Inaugural Dissertation - Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg

2.4. Hochauflösende Mikroskopiemethoden
r := I max − I min
I max
= 1 − A 1
A 2
(2.4.13)
wobei A 1 und A 2 die Amplituden der inneren und äußeren Einhüllenden der AID bezeichnen. Die so
definierte Modulationstiefe r verringert sich für größere Objekte und umgekehrt. Bei gegebener Objektform
ist es damit möglich, das Verhältnis zwischen Modulationstiefe und Objektgröße zu bestimmen,
indem die Faltung zwischen der axialen Projektion des Objekts mit dem axialen Profil der PSF berechnet
wird [Wag04]. Dies führt zu sogenannten R-S-Kurven, anhand derer das gemessene Verhältnis
R = A 1 /A 2 direkt mit der Objektgröße S in Relation gesetzt werden kann (siehe Abbildung 2.4.8).
Abbildung 2.4.7.: Die SMI-Messung ergibt für
jedes Objekt eine charakteristische axiale Intensitätsverteilung
(engl.: axial intensity distribution,
AID). Die Modulationstiefe r der AID ist proportional
zum Verhältnis der Amplituden A1 und A2
der inneren und äußeren Einhüllenden des Intensitätsprofils
(abgebildet ist die simulierte AID eines
100nm Objekts mit r=0,70) [Rey07].
Abbildung 2.4.8.: Über die Modulationstiefe
kann auf den Durchmesser des Objektes geschlossen
werden. Abgebildet ist der Zusammenhang
zwischen dem Durchmesser und der Modulationstiefe
für ein kugelförmiges Objekt für die drei
am SMI-Aufbau verfügbaren Wellenlängen (Brechungsindex:
1,47, vollständige Interferenz und
ein angenommener Winkel von 0 ◦ zwischen den
beiden Strahlen) [Bad07].
2.4.4. Lokalisationsmikroskopie
Die Lokalisationsmikroskopie liefert, ebenso wie die SMI-Mikroskopie, keine Auflösungsverbesserung
im klassischen Sinn. Auch bei dieser Methode wird die Strukturinformation unterhalb der Beugungsgrenze
erst durch eine nachträgliche Analyse der aufgenommenen Rohdaten erhalten. Im Gegensatz
zur 4PI- und zur SMI-Mikroskopie erhält man mit der Lokalisationsmikroskopie verbesserte Strukturinformation
in lateraler Richtung. Beruhen die beiden anderen Methoden auf dem Prinzip der
Interferenz, so wird bei der Lokalisationsmikroskopie ein anderes Prinzip angewendet. Anstatt die
PSF des optischen Systems zu verändern, werden hier Einzelmoleküle, deren Abstand zueinander
unterhalb der Beugungsgrenze liegt, über eine zeitliche Diskriminierung voneinander getrennt. Diese
Methode geht auf das Verfahren von SPDM (engl.: Spectral Precision Distance/ Position Determination
Microscopy) zurück, bei dem eine spektrale Diskriminierung der Einzelmoleküle durch Markierung mit
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