GP-Skript für WS 2013/2014 (pdf) - in der Biochemie
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Versuch: Nukle<strong>in</strong>säuren I- Genetischer F<strong>in</strong>gerpr<strong>in</strong>t -<br />
_________________________________________________________________________________________<br />
Programm PCR-Masch<strong>in</strong>e:<br />
1) 98°C 5 m<strong>in</strong> (Denaturieren und Aktivieren <strong>der</strong> Polymerase)<br />
2) 98°C 5 sec (Trennen <strong>der</strong> Stränge)<br />
59°C 10sec (Anlagern <strong>der</strong> Primer) 2 Wie<strong>der</strong>holungen<br />
72°C 5sec (Strangverlängerung)<br />
3) 98°C 5 sec (Trennen <strong>der</strong> Stränge)<br />
59°C 10sec (Anlagern <strong>der</strong> Primer) 35 Wie<strong>der</strong>holungen<br />
72°C 10sec (Strangverlängerung)<br />
4) 72°C 5 m<strong>in</strong> (Auffüllreaktion)<br />
5) 15°C Pause (Lagerung)<br />
E<strong>in</strong>e Woche später, vor Beg<strong>in</strong>n des Plasmid Versuches:<br />
1.Analytisches Agarose-Gel zur Überprüfung <strong>der</strong> PCR<br />
Die PCR-Probe wird auf das präparative Agarosegel aufgetragen und aufgetrennt. Wir<br />
schauen uns das Gel die aufgetragene und aufgetrennte DNA unter UV-Licht an.<br />
Ethidiumbromid <strong>in</strong>terkaliert <strong>in</strong> den DNA-Doppelstrang und macht somit die DNA unter UV-<br />
Licht sichtbar.<br />
Material:<br />
Agarose (MoSieve Agarose MS 1000, Peqlab )<br />
Mikrowelle<br />
Erlenmeyerkolben<br />
1x TAE-Elektrophorese Puffer<br />
steriles Wasser<br />
Standard: GeneRuler 100bp Lad<strong>der</strong> plus von Fermentas)<br />
Ethidiumbromidstammlösung <strong>in</strong> Tropfflasche(0,07%))<br />
Gelapparatur<br />
Durchführung:<br />
‣ Agarose (3 %) <strong>in</strong> e<strong>in</strong>en Erlenmeyerkolben abwiegen<br />
‣ 1x TAE-Elektrophorese Puffer zugeben (50ml <strong>für</strong> mittlere Gelgröße)<br />
‣ Alles wiegen, Gesamtgewicht aufschreiben<br />
ACHTUNG! AGAROSE FÜR DIE ELEKTROPHORESE NIEMALS IN WASSER LÖSEN, IMMER PUFFER<br />
NEHMEN!<br />
‣ zum Schmelzen die Agarose <strong>in</strong> <strong>der</strong> Mikrowelle kochen, bis e<strong>in</strong>e klare Lösung entsteht<br />
ACHTUNG! BEIM KOCHEN IN DER MIKROWELLE KANN EIN SIEDEVERZUG ENTSTEHEN, DESHALB<br />
BEIM SCHÜTTELN DER LÖSUNG SCHUTZBRILLE TRAGEN!<br />
‣ Fehlendes Gewicht mit Wasser auffüllen<br />
‣ Lösung unter Schütteln etwas abkühlen lassen<br />
‣ Unter dem laufenden Abzug Ethidiumbromid zugeben, kurz mischen<br />
ACHTUNG ETHIDIUMBROMID BZW. E.-DAMPF IST KREBSERREGEND!<br />
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