GP-Skript für WS 2013/2014 (pdf) - in der Biochemie
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Versuch Nukle<strong>in</strong>säuren II - RNA -<br />
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5. DNA-Amplifikation <strong>der</strong> mRNA-Varianten CLU35 bzw. CLU36 mittels<br />
PCR<br />
Material:<br />
Erststrang (revers-transkribierte Gesamt-RNA CLU35-HEK293 Zellen o<strong>der</strong> CLU36-<br />
HEK293 Zellen) und die –RT-Kontrolle<br />
Taq-Polymerase Maxima Hot Start Green Mix Fermentas (2fach konzentriert, enthält:<br />
Puffer <strong>für</strong> PCR, dNTP-Mix, MgCl 2 , Hot Start Taq-DNA-Polymerase, Auftragspuffer)<br />
Primer: a) CLU35-Ex1b-F2 (Nr.562) und CLU-34-36-R2 (Nr.485) (jeweils 10pmol/µl)<br />
b) CLU36-Ex1c-F2 (Nr.563) und CLU-34-36-R2 (Nr.485) (jeweils 10pmol/µl)<br />
c) GAPDH-Rat-F2(Nr.453) und GAPDH-Rat-R2 (Nr.454) (jeweils 10pmol/µl)<br />
Durchführung:<br />
‣ Jede Gruppe setzt 3 PCR´s mit ihrem Erststrang und 1 PCR mit <strong>der</strong> –RT-Kontrolle<br />
an<br />
1. CLU35 2. CLU36 3. GAPDH 4. GAPDH –RT-<br />
KONTROLLE<br />
10µl Hot Start Mix 2x 10µl Hot Start Mix 2x 10µl Hot Start Mix 2x 10µl Hot Start Mix 2x<br />
8µl 1. Strang 8µl 1. Strang 8µl 1. Strang 8µl -RT-Kontrolle<br />
1µl CLU35-Ex1b-F2 1µl CLU36-Ex1c-F2 1µl GAPDH-Rat-F2 1µl GAPDH-Rat-F2<br />
1µl CLU-34-36-R2 1µl CLU-34-36-R2 1µl GAPDH-Rat-R2 1µl GAPDH-Rat-R2<br />
20µl Gesamtvolumen 20µl Gesamtvolumen 20µl Gesamtvolumen 20µ Gesamtvolumen<br />
PCR-Programm:<br />
Initiale Denaturierung, Taq-Aktivierung: 15m<strong>in</strong> 95°C<br />
Denaturierung: 30sec 95°C<br />
Anneal<strong>in</strong>g: 30sec 56°C 23 Zyklen<br />
Elongation: 30sec 72°C<br />
F<strong>in</strong>al Extension: 10m<strong>in</strong> 72°C<br />
‣ Nach Abschluss <strong>der</strong> PCR werden die 20µl auf e<strong>in</strong> Agarosegel (2% MoSieve Agarose<br />
MS 1000, Peqlab) aufgetragen und elektrophoretisch getrennt.<br />
‣ Wichtig: Dies geschieht e<strong>in</strong>e Woche später. Deshalb bitte die nächste Woche<br />
schon um 12.45 Uhr kommen zum PCR-Auftrag.<br />
Protokoll:<br />
1. Ist die PCR erfolgreich verlaufen<br />
2. Bestimmung <strong>der</strong> Größe des amplifizierten PCR-Fragments und Vergleich mit <strong>der</strong> zu<br />
erwartenden (theoretischen) Größe <strong>der</strong> spezifischen cDNA.<br />
3. Welche CLU-mRNA-Variante wird <strong>in</strong> den von Ihnen untersuchten HEK293-Zellen<br />
exprimiert<br />
4. Ist die Erststrangsynthese erfolgreich verlaufen Woran ist dies zu erkennen<br />
5. S<strong>in</strong>d <strong>in</strong> <strong>der</strong> –RT-Kontroll-PCR DNA-Banden zu erkennen Falls ja, wie s<strong>in</strong>d diese<br />
Banden entstanden<br />
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