GP-Skript für WS 2013/2014 (pdf) - in der Biochemie

Inhaltsverzeichnis
Infos zum Praktikum ..................................................................................................... 6
Allgemeines ............................................................................................................................... 6
Sicherheitsmaßnahmen und Arbeitsschutz ................................................................................. 7
Nukleinsäuren I ........................................................................................................... 17
Deckblatt: Nukleinsäuren I .................................................................................................... 17
Genetischer Fingerprint: .......................................................................................................... 18
DNA Isolierung aus Mundschleimhautzellen und anschließende Multiplex-PCR; Prinzip des
Vaterschaftstests/DNA-Fingerprinting ...................................................................................... 18
Theorie zu DNA und PCR ..................................................................................................... 18
1. Isolierung der DNA ........................................................................................................... 20
2. Multiplex-Polymerase Ketten Reaktion .............................................................................. 23
1.Analytisches Agarose-Gel zur Überprüfung der PCR ......................................................... 24
Nukleinsäuren II .......................................................................................................... 26
Deckblatt: Nukleinsäuren II ................................................................................................... 26
RNA-Isolierung und Nachweis einer spezifischen mRNA mittels RT-PCR ................................. 27
Theoretischer Teil................................................................................................................. 27
1. Isolierung von Gesamt-RNA aus Säugerzellen .................................................................. 29
2. Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der RNA ......................................................... 31
3. Reverse Transkription der RNA (Erststrangsynthese) ....................................................... 31
4. Denaturierende Agarosegelelektrophorese von Gesamt-RNA ........................................... 32
5. DNA-Amplifikation der mRNA-Varianten CLU35 bzw. CLU36 mittels PCR ......................... 34
6. Anlagen ............................................................................................................................ 35
Nukleinsäuren III ......................................................................................................... 39
Deckblatt: Nukleinsäuren III .................................................................................................. 39
Isolierung eines rekombinanten Plasmids aus E. coli und dessen............................................. 40
Charakterisierung mittels Restriktionsanalyse .......................................................................... 40
Theorie zu Plasmiden und Restriktion ................................................................................... 40
1. Plasmid-DNA-Minipräparation ........................................................................................... 41
1. Plasmidisolierung: .......................................................................................................... 42
2. Konzentrationsbestimmung der Plasmidlösung ................................................................. 43
3. Restriktion des isolierten Plasmids pUC19-gp80-cDNA mit PvuII ...................................... 44
4. Agarosegelelektrophorese ................................................................................................ 44
5. Auswertung und Protokoll ................................................................................................. 45
6. Anlagen ............................................................................................................................ 46
Proteine I ...................................................................................................................... 52
Deckblatt: Proteine I ............................................................................................................. 52
Auftrennung von Milchproteinfraktionen und Kristallisation von Laktose ................................ 54
Theorie zu Milchproteinen .................................................................................................... 54
Bestimmung des pH-Werts von Milch.................................................................................... 55
Fällung von Casein und Molke Proteinen .............................................................................. 55
Proteine II ..................................................................................................................... 57
Deckblatt: Proteine II ............................................................................................................ 57
SDS-PAGE der Milchproteine und Auswiegen der Laktose ....................................................... 58
SDS-PAGE der Milchproteine ............................................................................................... 58
Theorie zu SDS-PAGE ......................................................................................................... 58
Herstellung der Proben ......................................................................................................... 60
Trocknen und Auswiegen der Laktose .................................................................................. 62
Kohlenhydrate I ........................................................................................................... 63
Deckblatt: Kohlehydrate........................................................................................................ 63
Analyse des Milchzuckers und Färben der SDS-PAGEs ........................................................... 64
Färben von Phospho- und Gesamt-Proteinen der Milch ........................................................ 64
Theorie zu Proteinphosphorylierung ..................................................................................... 64
Analyse des Milchzuckers..................................................................................................... 65
Enzymkinetik ............................................................................................................... 68
Deckblatt : Enzymkinetik....................................................................................................... 68
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