GP-Skript für WS 2013/2014 (pdf) - in der Biochemie

Versuch Nukleinsäuren III – Plasmidrestriktion -
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bei 280 nm nur noch halb so viel Strahlung; das Verhältnis OD 260nm /OD 280nm reiner
Nukleinsäurelösung beträgt 1,8-2,0.
Ist eine DNA-Lösung noch mit Proteinen verunreinigt, so steigt die OD 280nm und der
Quotient OD 260nm /OD 280nm wird kleiner
Auswertung: Bestimmung der Konzentration des präparierten Plasmids (in µg/µl) und
dessen Reinheitsgehalts
Das Eppi mit der Plasmidlösung mit Namen (eigener Name), Datum, Plasmid-
Bezeichnung und der Konzentration in µg/µl beschriften. Sofort die Restriktion mit
PvuII ansetzen!
3. Restriktion des isolierten Plasmids pUC19-gp80-cDNA mit PvuII
Zur Überprüfung der Orientierung der einklonierten gp80-Sequenz wird die isolierte
Plasmid-DNA mit PvuII restringiert.
Restriktionsansatz:
µl Plasmid DNA (soll ca. 2µg entsprechen)
2.5 µl 10fach Puffer PvuII (Fast Digest, incl. Auftragspuffer!)
µl H 2 O
1 µl PvuII (Fast Digest)
25 µl Endvolumen
‣ 30 Minuten bei 37 °C in Brutschrank
‣ anschließend komplette Restriktion aufs Gel auftragen
4. Agarosegelelektrophorese
Je nach Anwendung werden unterschiedlich prozentige Agarosegele gegossen. Zur
Auftrennung kleiner Fragmente hochprozentig, zur Auftrennung großer Fragmente
niedrigprozentig.
Material:
5 Gele a´10er Kämme 1mm
Agarose MoSieve MS1000 von Peqlab
Erlenmeyerkolben
1x TAE-Elektrophoresepuffer (Tris-Acetat-EDTA-Puffer)
10x Auftragspuffer DNA (10x AP) für Gelproben
Massruler bzw. Generuler 100bp-ladder von Fermentas
Ethidiumbromidlösung 0,07% aus Tropfflasche
Gelapparatur
Durchführung:
‣ 1,5 % (w/v) MoSieve Agarose in einen Erlenmeyerkolben abwiegen
‣ 1x TAE-Elektrophoresepuffer zugeben (80ml für mittlere Gelgröße), Kolben wiegen
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