GP-Skript für WS 2013/2014 (pdf) - in der Biochemie

Versuch Nukleinsäuren II - RNA -
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Durchführung:
‣
‣ Kulturmedium aus einer mit konfluenten HEK293-Zellen bewachsenen Schale in
Abfallflasche überführen (abkippen des Mediums in die Flüssig-Abfallflasche,
Petrischale schräghalten und Rest mit blauer Pipettenspitze abziehen)
‣ 1ml PBS-Puffer in die Zellkulturschale geben, dann Zellen mit 1ml Pipette durch
aufziehen des PBS und auspipettieren über den Gefäßboden ablösen und sammeln
(Schale dabei schräg halten und mehrmals über den Gefäßboden auspipettieren!)
‣ Zellsuspension noch in der Schale durch vorsichtiges auf und abziehen etwas
vereinzeln und dann vollständig mit blauer Pipettenspitze in ein 1,5 ml Eppi
überführen
‣ Zentrifugation (2min, 300×g)
‣ Überstand vorsichtig und vollständig abziehen (erst blaue, dann gelbe Pipettenspitze
verwenden) und in den Abfallbehälter verwerfen.
‣ Zellpellet in 400 µl Lysis-Puffer RL, durch auf und ab pipettieren, resuspendieren,
2min Raumtemperatur inkubieren
‣ Zellpellet noch einmal durch auf und ab Pipettieren vollständig resuspendieren (es
sollen keine Zellklumpen mehr zu erkennen sein) und weitere 3 min bei
Raumtemperatur inkubieren
‣ dann das komplettes Zelllysat auf das Zentrifugen Säulchen D (blau) geben
‣ Zentrifugation (2 min, 12.000rpm)
‣ Säulchen verwerfen (enthält gebundene genomische DNA) Durchfluss
weiterverwenden, enthält RNA!
‣ Durchfluss=RNA + 400 µl (ca. 1 Vol.) 70%-DEPC-Ethanol, mischen
‣ Durchfluss komplett in das Zentrifugensäulchen R (violett) geben
‣ Zentrifugation (2 min, 12.000rpm)
‣ Durchfluss verwerfen, Säulchen mit gebundener RNA in frisches Auffanggefäß
stellen
‣ 750 µl Waschpuffer HS auf Säulchen geben
‣ Zentrifugation (1 min, 12.000rpm)
‣ Durchfluss verwerfen,
‣ 500 µl Waschpuffer LS auf Säulchen geben
‣ Zentrifugation (1 min, 12.000rpm)
‣ Durchfluss verwerfen, Säulchen mit gebundener RNA in frisches Auffanggefäß
stellen
‣ Trocken-Zentrifugation (3 min, 12.000rpm), Säulchen muss trocken sein
‣ Säulchen mit gebundener RNA in ein frisches steriles 1,5 ml Eppi stellen (vorher
Deckel abschneiden auf Kleenex und aufheben)
‣ 60 µl DEPC-ddH 2 O auf das Säulchen Material geben, 1 min bei Raumtemperatur
inkubieren
‣ Zentrifugation (1 min, 8.000rpm)
‣ Durchfluss enthält eluierte RNA (bitte beschriften: Name, Gruppennummer)
‣ RNA dann immer auf Eis lagern!
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