GP-Skript für WS 2013/2014 (pdf) - in der Biochemie

Versuch Nukleinsäuren II - RNA -
_________________________________________________________________________________________
1. Probe 2. Kontrolle ohne RT (-RT)
.µl RNA (entspricht 2,5µg)
µl RNA (entspricht 2,5µg)
1 µl Oligo dT-Primer
µl MP H2O
µl MP H2O
ergibt 13 µl, Zugabe von
4µl 5x Reaktionspuffer
2µl dNTP Mix 10mM
1µl RevertAid Reverse Transkriptase
ergibt 20µl Endvolumen
ergibt 20µl Endvolumen
‣ Reaktion für 60min bei 42°C (im PCR-Cycler)
‣ Inaktivierung des Enzyms 10min 70°C (im PCR-Cycler)
‣ kurz abzentrifugieren und Ansatz mit 180µl MP-H 2 O auf 200µl auffüllen und mischen
‣ auf Eis lagern oder -20°C
4. Denaturierende Agarosegelelektrophorese von Gesamt-RNA
Die denaturierende Agarosegelelektrophorese dient zur Überprüfung der Qualität der
präparierten Gesamt-RNA. Hiermit soll sichergestellt werden, dass für die
Erststrangsynthese ausschließlich nicht-degradierte RNA-Proben verwendet werden.
Material:
MOPS/EDTA, pH 7.0: 40mM MOPS (3-(N-Morpholino-)-propansulfonsäure
o 10mM Natriumacetat
o 1mM EDTA
RNA-Probenpuffer:
50% Gylcerin
o 0.25% Bromophenolblau
o 1mM EDTA
RNA-Marker RiboRuler High Range RNA-Ladder, SM 1821/3 Fermentas
Formaldehyd (37%) (immer neu aliquotieren 15µl)
Formamid (immer neu aliquotieren 50µl)
Ethidiumbromid-Färbelösung (0.5µg/ml)
Agarose (Universal Gold von Peqlab)
Speed Vac (Zentrifuge die unter Vakuum arbeitet)
Durchführung:
Gelgießen
‣ Das Gießen des Gels wird von den Betreuern gemacht
‣ 2.5g Agarose in einen 300ml-Erlenmeyerkolben abwiegen
‣ 184ml DEPC-behandeltem Wasser zugeben, wiegen, Waage austarieren
‣ in der Mikrowelle aufkochen, bis sich die Agarose vollständig gelöst hat.
32