GP-Skript für WS 2013/2014 (pdf) - in der Biochemie

Versuch Nukleinsäuren III – Plasmidrestriktion -
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1. Plasmidisolierung:
Es wird aus der Über-Nacht-Kulturen transformierter E. coli Xl1-blue (2x 100ml +Amp) das
Plasmid präpariert. Dies erfolgt chromatographisch mit Hilfe von Silika-Zentrifugensäulchen.
Material:
5ml LB-Flüssigkulturen (E. coli Xl1-blue mit pUC19-gp80-cDNA, sense oder
antisense, Rack 7/2) in Greinerröhrchen
GeneJet Plamid Minipräp-Kit Fermentas, dieser Kit beinhaltet alle unten zu
verwendenden Puffer.
10 mM Tris, pH 8.5
Durchführung:
ACHTUNG! BEI GENTECHNISCHEN ARBEITEN MÜSSEN ALLE ABFÄLLE IN AUTOKLAVIERBEUTELN
GESAMMELT UND SPÄTER FÜR 20 MIN BEI 121°C AUTOKLAVIERT WERDEN!
‣ 5 ml XL1blue-Bakterien (transformiert mit dem rekombinanten Plasmid pUC19-gp80)
im 15 ml-Greineröhrchen für 5 min bei 5000 rpm abzentrifugieren (zusammen in
Zentrifuge Raum Nr. 215)
‣ Überstand verwerfen in Flüssigabfall und Reste an LB-Medium vollständig mit
gelber Pipettenspitze abziehen
‣ Bakterien sorgfältig in 250 l Resuspension Solution (RS) resuspendieren
(langsam auf- und abpipettieren, evtl. vortexen) und in ein 1,5 ml Eppendorf-
Reaktionsgefäß (im folgenden Eppi genannt) überführen (das vollständige
Resuspendieren der pelletierten Bakterien ist für gute Plasmiderträge von entscheidender
Bedeutung!)
‣ 250 l Lysis Solution (LS) zugeben und durch vier- bis sechsmaliges Invertieren
des Eppis mischen, bis ein klares Lysat entsteht.
‣ 350 l Neutralisation Solution (NS) zugeben und 4-6mal invertieren.
‣ 5 Minuten bei 12.000 x g (11.000rpm) und Raumtemperatur zentrifugieren.
‣ Den klaren Überstand auf die GeneJet Spin Säule (blau) pipettieren (Säule steckt in
einem 2 ml Eppi, kein flockiges Präzipitat auf die Säule bringen; Betreuer fragen)
‣ 1 Minute bei 12.000g zentrifugieren, bis das Lysat vollständig die Silikamembran
passiert hat. Den Säulendurchfluss verwerfen und die Säule und das Eppi
weiterverwenden.
‣ 500 l Wasch-Puffer (WP) auf die Säule pipettieren, für 1 Minute bei 12.000 x g
zentrifugieren, den Säulendurchfluss verwerfen und die Säule und das Eppi im
nächsten Schritt weiterverwenden.
‣ Waschschritt wiederholen: 500 l Wash-Puffer (WP) auf die Säule pipettieren, für 1
Minute bei 12.000 x g zentrifugieren, den Säulendurchfluss verwerfen und die
Säule und das Eppi im nächsten Schritt weiterverwenden.
‣ Säulchen wieder in das Eppi setzen und Trocknen zentrifugieren (1 min, 12000g,
essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!)
‣ Säulchen in ein neues steriles 1,5 ml Eppi stellen (Deckel vorher abscheiden) und
die Plasmid-DNA eluieren. Hierzu 50 µl Elutionspuffer (EP) direkt auf die
Säulenmatrix pipettieren, 2 Minuten einwirken lassen und anschließend für 2
Minuten bei 12000 x g zentrifugieren.
‣ Säule in Abfall werfen und mit dem abgeschnittenen Deckel das Eppi verschließen
‣ Die eluierte Plasmid-Lösung, ca. 50µl, werden wie folgt verwendet:
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