GP-Skript für WS 2013/2014 (pdf) - in der Biochemie

Versuch Nukleinsäuren III – Plasmidrestriktion -
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Isolierung eines rekombinanten Plasmids aus E. coli und dessen
Charakterisierung mittels Restriktionsanalyse
Betreuung: Philipp Rohne, Christina Weindel
Wichtig: Bitte schon 12.45 Uhr da sein zum Auftragen der PCR von letzter Woche
Theorie zu Plasmiden und Restriktion
Bakterien können neben ihrer als Nucleoid (= Kernäquivalent, „Bakterienchromosom“)
bezeichneten, genomischen DNA auch kleine, ringförmige DNA-Moleküle, sog. Plasmide
besitzen. Diese tragen Gene, die im Normalfall für das Überleben des Organismus nicht
entscheidend sind, jedoch unter gewissen äußeren Bedingungen diesem einen immensen
Vorteil verschaffen können (z.B. Antibiotikaresistenz). Aufgrund ihrer geringen Größe und
autonomen Replikation können sie in der Gentechnik als Vektoren benutzt werden, also
zum Einbringen von Fremd-DNA in Bakterien (Transformation) oder Säugerzellen
(Transfektion) genutzt werden. Bei diesen Plasmidvektoren handelt sich nicht um natürlich
vorkommende Plasmide, sondern um gentechnisch hergestellte künstliche Plasmide. Um
diese Plasmidvektoren effizient nutzen zu können, sollten sie folgende Eigenschaften
besitzen:
Der Vektor muss ein sogenanntes Replikon (ori) tragen, das seine Vermehrung im Wirt
(meist Bakterien) gewährleistet. Ein Vektor sollte einen als MCS (multiple cloning site)
oder auch Polylinker bezeichneten Abschnitt besitzen, der möglichst viele
Erkennungssequenzen für verschiedene Restriktionsendonukleasen besitzt, in den Fremd-
DNA einkloniert werden kann (Polylinker). Die in der MCS vorhandenen
Erkennungssequenzen sollten einzigartig sein, d.h. an keiner anderen Stelle des Plasmids
ein weiteres Mal vorkommen, um ein gezieltes „Öffnen“ des Plasmidrings zu ermöglichen,
nicht jedoch ein „Zerschneiden“ des Plasmids in mehrere DNA-Fragmente zur Folge
haben.
Er sollte Informationen tragen, die eine Selektion von Bakterien, welche das unveränderte
Plasmid bzw. das neu rekombinierte Plasmid (Plasmid mit integrierter Fremd-DNA) tragen,
ermöglichen. Häufig verwendete Selektiongene für plasmidtragende Zellen sind
Antibiotikaresistenzgene. Ein zweites Selektionsgen sollte sich in dem Bereich des
Plasmides befinden, in den die Fremd-DNA eingebracht wird. Die Inaktivierung dieses
Selektionsgens durch die Integration von Fremd-DNA zeigt dann an, dass sich Fremd-
DNA im Plasmid befindet. Das im Praktikum benutzte Plasmid pUC19 enthält ein
Ampicillinresistenzgen (kodiert für das Enzym -Lactamase), so dass Bakterien mit
diesem Plasmid auf einem ampicillinhaltigem Nährboden wachsen können. Als zweiten
Marker besitzt pUC19 das LacZ‘-Gen, welches für die -Untereinheit der ß-Galactosidase
kodiert. Dieses Gen befindet sich in dem Bereich des Vektors, in den die Fremd-DNA
integriert wird (MCS: multiple cloning site oder auch Polylinker genannt) und was eine
Inaktivierung des LacZ‘-Gens bewirkt (Stichwort: Blau-Weiß-Selektion, -
Komplementation, Lac-Operon).
Soll nach der Insertion die Fremd-DNA zur Expression eines Proteins verwendet werden,
so müssen sich auf dem Plasmid in korrekten Positionen entsprechende Kontrollelemente
(Promotor, Polyadenylierungssignal) befinden.
Die Nukleotidsequenz des Plasmides sollte bekannt sein.
Methoden zum Zerschneiden von DNA in diskrete Fragmente waren bis gegen Ende der
60er Jahre unbekannt. Die Lösung dieser Frage ergab sich aus langjährigen Arbeiten zur
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