horizonte - der Koordinierungsstelle - Hochschule Mannheim

Messung der Wärmeproduktion von Bakterien im Bioreaktor: Kalorimetrische Regelung
von Bioprozessen zur Herstellung von rekombinanten Proteinen
Richard Biener, Anne Steinkämper, Thomas Horn, Johannes Hofmann, Hochschule Esslingen
Rekombinante Proteine wie z.B. Insulin oder Interferone gehören zu den wichtigsten Produkten der modernen Biotechnologie.
Hergestellt werden rekombinante Proteine mit gentechnisch veränderten Organismen (GVO). Hier kommen
neben den Mikroorganismen (E.coli oder Hefezellen) auch tierische Zellkulturen zum Einsatz. Zur Erhöhung der Produktivität
und der Reproduzierbarkeit des Kultivierungsprozesses ist eine automatisierte Prozessführung erforderlich. Im Beitrag
wird gezeigt, wie mit Hilfe kalorimetrischer Methoden die spezifi sche Wachstumsrate von Mikroorganismen während der
Kultivierung in einem Standard-Bioreaktor geregelt werden kann. Diese Automatisierungsstrategie führt zu einer deutlichen
Steigerung der Produktivität und Reproduzierbarkeit des Prozesses.
Bedeutung der Hochzelldichtekultivierung
in der pharmazeutischen Industrie
Gentechnisch hergestellte Proteine,
so genannte rekombinante Proteine,
werden in der pharmazeutischen Industrie
mit Hilfe gentechnisch veränderter,
lebender Mikroorganismen oder Zelllinien
hergestellt. Allgemein werden
diese als Biopharmazeutika bezeichnet.
Beispiele für diese unverzichtbar
gewordenen Arzneimittel sind Insuline,
monoklonale Antikörper oder Erythropoetine.
Beim Herstellungsprozess
eines Biopharmazeutikums produzieren
diese gentechnisch modifi zierten
Bakterien, Hefen oder Säugetierzellen
in einem Bioreaktor das entsprechende
Protein. Zur Erhöhung der Proteinausbeute
werden in der biopharmazeutischen
Industrie Hochzelldichte-Fed-
Batch-Prozesse eingesetzt [1, 2]. Um
hohe Zelldichten zu erzielen, wird bei
diesen Prozessen mit Hilfe einer Pumpe
dem Bioreaktor ein konzentriertes
Nährmedium kontinuierlich zugeführt.
Über diese Zufütterung kann direkt
das Zellwachstum und die Produktion
störender Nebenprodukte beeinfl usst
werden. Nebenprodukte sind in diesen
Prozessen unerwünscht, da sie das
Wachstum der Zellen inhibieren, woraus
auch eine geringe Proteinausbeute
resultiert.
Insulin, Interferon und weitere Arzneistoffe
werden weit verbreitet von
gentechnisch veränderten Escherichia
coli Bakterien hergestellt. Um die Produktivität
von rekombinanten Proteinen
in E. coli zu maximieren, muss
die Zufütterung des Nährmediums mit
der wachstumslimitierenden Kohlenstoff-Quelle
(z.B. Glucose) so erfolgen,
dass die Wachstumsrate der Bakterien
unter einem kritischen Wert gehalten
wird. Damit kann die Produktion von
wachstumsinhibierenden Nebenprodukten
(z.B. Acetat) minimiert werden
und die Bakterien können ungehindert
wachsen. Durch diese Zufütterungs-
strategie können Biotrockenmasse-
Konzentrationen von mehr als 100 g/l
erreicht werden [1]. Diese hohen Zelldichten
führen wiederum zu hohen
Proteinkonzentrationen. Die eingestellte
Wachstumsrate sollte allerdings
nicht zu klein sein, um die Prozessdauer
möglichst kurz zu halten.
Prozessführungsstrategien
Für Hochzelldichte-Kultivierungsprozesse
sind unterschiedliche Strategien
in der Literatur beschrieben. Eine
häufi g angewandte Methode ist die
Zufütterung mit einem vorab festgelegten
Profi l. Nachdem die Kohlenstoff-
Quelle (z.B. Glucose) im Nährmedium
verbraucht ist, wird dabei die Feeding-Rate
exponentiell erhöht, um die
spezifi sche Wachstumsrate näherungsweise
konstant zu halten [3]. Ein fest
vorgegebenes Zufütterungsprofi l hat
im Wesentlichen den Nachteil, dass es
bei einer falschen Abschätzung der Parameter
oder bei einer Prozessstörung
zu einer Überfütterung des limitierenden
Substrats Glucose und damit auch
zu einer erhöhten Acetatproduktion
kommen kann. Daher ist es von Vorteil,
eine geregelte Zufütterung vorzunehmen.
In der Praxis werden oft indirekte
Messgrößen für die Einstellung
der Feedrate verwendet. Beispielsweise
wird bei der DO-stat Methode die
Feedrate über die Messung der Gelöstsauerstoffkonzentration
(pO 2 ) geregelt.
Wenn die wachstumslimitierende C-
Quelle verbraucht ist, führt dies zu einem
Anstieg des pO 2 und die Feedrate
muss entsprechend angepasst werden,
um den Substratmangel auszugleichen
[4, 5]. Beim pH-stat wird die Feedrate
aufgrund von Veränderungen des pH-
Werts bei einem Substratmangel eingestellt
[6]. Bei beiden Strategien wird
die spezifi sche Wachstumsrate indirekt
durch den pH oder den pO 2 geregelt.
Folglich ist eine konstante spezifi sche
Wachstumsrate schwierig zu verwirklichen
[7].
Prof. Dr.-Ing. R. Biener
Dipl. Biol. t. o. A. Steinkämper
Dipl.-Ing. (FH) T. Horn
Dipl.-Ing. (FH) J. Hofmann
horizonte 40/ September 2012 - 3 -