Schwerpunkt: „Reproduktionsmedizin“ - Tierärztliche Hochschule ...

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Forschung fürs Leben 2005
Schwerpunkt:
„Reproduktionsmedizin“

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Therapie von Infektionskrankheiten bei Rindern und Schweinen, hervorgerufen durch folgende Enrofloxacin-empfindliche gramnegative und grampositive Bakterien sowie Mykoplasmen: Rind: Bakteriell bedingte Erkrankungen des Respirations- und
Digestionstraktes (Pasteurellose, Mykoplasmose, Colibazillose, Coliseptikämie) bakterielle Sekundärerkrankungen (z.B. im Rindergrippe-Crowding-Komplex) sowie akute E.-coli-Mastitiden mit gestörtem Allgemeinbefinden. - E. coli, Haemophilus spp.,
Pasteurella spp., Mycoplasma bovis. Schwein: Bakteriell bedingte Erkrankungen des Digestions- (Colidiarrhoe, Coliseptikämie) und Respirationstraktes (enzootische Pneumonie), MMA-Syndrom der Sauen. - E. coli, Pasteurella spp., Mycoplasma hyopneumoniae.
Gegenanzeigen: Vorliegende Resistenz gegenüber Chinolonen, da gegenüber diesen eine nahezu vollständige, gegenüber anderen Fluochinolonen eine komplette Kreuzresistenz besteht. Bereits bestehende Knorpelwachstumsstörungen
oder Schädigungen des Bewegungsapparates im Bereich funktionell besonders beanspruchter oder durch das Körpergewicht belasteter Gelenke. Tiere mit bekannter Überempfindlichkeit gegen Fluochinolone sollte nicht mit Enrofloxacin therapiert
werden. Nebenwirkungen: Es kann zu vorübergehenden lokalen Reaktionen an der Injektionsstelle kommen. In seltenen Fällen kann die i.v. Behandlung bei Rindern, vermutlich als Folge von Kreislaufstörungen, zum Auftreten von Schockreaktionen
führen. Vereinzelt ist unter der Behandlung bei Rindern mit dem Auftreten von gastrointestinalen Störungen zu rechnen. Wechselwirkungen: Bei der Kombination von Baytril ® (Enrofloxacin) mit Makroliden oder Tetrazyklinen ist mit antagonistischen
Effekten zu rechnen. Wartezeit: Rind: Essbare Gewebe: i.v.: 7 Tage, s.c.: 14 Tage, Milch: i.v.: 3 Tage, s.c.: 5 Tage; Schwein: Essbare Gewebe: i.m.: 9 Tage. Verschreibungspflichtig. Bayer HealthCare, Bayer Vital GmbH, Geschäftsbereich Tiergesundheit,
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2
Dagmar Waberski, Burkhard Meinecke
Das Fachgebiet Reproduktionsmedizin wird an der Stiftung Tierärztliche
Hochschule Hannover vom Institut für Reproduktionsmedizin,
den Tierartenkliniken vertreten. Mit der Gründung des Virtuellen
Zentrums für Reproduktionsmedizin Niedersachsen an der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover im Jahr 2004 werden durch
institutsübergreifende Kooperationen die Belange des Fachgebietes
in Forschung, Lehre und Dienstleistung synergistisch bearbeitet.
Insbesondere die steigenden Anforderungen einer wettbewerbsfähigen
landwirtschaftlichen Tierproduktion, aber auch die
zunehmende Erwartungshaltung von Pferde- und Hundezüchtern
erfordern eine interdisziplinäre Zusammenarbeit zwischen Reproduktionsmedizinern
und -biologen. Mit der Gründung des Virtuellen
Zentrums wird dem Stellenwert und den Bedürfnissen der Reproduktionsforschung
in der Tiermedizin Rechnung getragen.
In fünf Einrichtungen innerhalb der TiHo, sowie in der Bundesforschungsanstalt
für Landwirtschaft (FAL) Mariensee und im Landgestüt
Celle wird derzeit Forschung im Virtuellen Zentrum für
Reproduktionsmedizin betrieben. Das vorliegende Magazin berichtet
beispielhaft über die Forschungsaktivitäten innerhalb des Zentrums
und über die Forschungskooperationen mit anderen Institutionen.
Dabei kommt der Entwicklung und Anwendung von Biotechnologien,
wie Besamung, Embryotransfer, In-vitro-Produktion von
Embryonen und assoziierten Techniken, eine besondere Bedeutung
zu. Fortschritte in diesen Bereichen setzen das zunehmende Verständnis
reproduktionsphysiologischer Mechanismen voraus. Die
Physiologie der Fortpflanzung auf zellulärer und molekularer Ebene
Vorwort
Forschung im Virtuellen Zentrum für
Reproduktionsmedizin Niedersachsen
Impressum
Herausgeber
Der Präsident der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Redaktion und Vertrieb
Presse- und Öffentlichkeitsarbeit
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Sonja von Brethorst
Judith Mc Alister-Hermann, PhD
Bünteweg 2
30559 Hannover
Tel.: (05 11) 9 53-80 02
Fax: (05 11) 9 53-82 80 02
E-Mail: presse@tiho-hannover.de
Literaturnachweis
Umfangreiche Literaturnachweise liegen bei den Autoren vor und
können dort angefordert werden.
bildet daher einen Schwerpunkt in den Forschungsaktivitäten.
Untersuchungen zur Herdenfruchtbarkeit und zum Reproduktionsmanagement
besitzen einen hohen Stellwert für eine effiziente
Reproduktionsleistung landwirtschaftlicher Nutztiere und bilden
eine weitere wesentliche Ausrichtung der Forschungsaktivitäten
des Zentrums.
Neben der Forschung erfolgt eine gezielte Nachwuchsförderung in
Praxis und Wissenschaft über spezielle Lehrangebote im Grundund
PhD-Studium. Die Forschungsaktivitäten orientieren sich an
den Notwendigkeiten einer leistungsfähigen wettbewerbsfähigen
Tierproduktion und werden zu wesentlichen Anteilen von der Deutschen
Forschungsgemeinschaft, den Besamungszuchtorganisationen
und der Industrie gefördert. Die Mitglieder des Virtuellen Zentrums
genießen national und international hohe Reputation, so dass
den deutschen Tierzüchtern mit dem Virtuellen Zentrum für Reproduktionsmedizin
eine interdisziplinär ausgerichtete Kompetenzeinrichtung
für alle Spezies zur Verfügung steht.
Verlag, Titel und Layout
VMK Verlag für Marketing & Kommunikation GmbH & Co. KG
Faberstraße 17
67590 Monsheim
Tel.: (0 62 43) 9 09-0
Fax: (0 62 43) 9 09-4 00
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Inhaltsverzeichnis
Steigerung der Reproduktionseffizienz bei landwirtschaftlichen Nutztieren 6
Dagmar Waberski
Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
Die gestresste Gebärmutter – Ursache für die Gebärmutterentzündung bei der Kuh? 9
Holm Zerbe, Torge König, Hans-Joachim Schuberth, Wolfgang Leibold
Klinik für Wiederkäuer der Ludwig-Maximilians-Universität München
Arbeitsgruppe Immunologie der TiHo
Detektion und Auswirkungen anabol wirksamer Substanzen an peripubertären Pferdehengsten 12
Bettina Zingrebe, Melanie Köllmann, Erich Klug
Klinik für Pferde der TiHo
Molekulargenetische Untersuchungen zur Fruchtbarkeit von Hengsten 15
Tosso Leeb, Rony Jude, Henning Hamann, Ottmar Distl, Harald Sieme, Edda Töpfer-Petersen
Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der TiHo
Niedersächsisches Landgestüt Celle
Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
Einfluss von Inseminatkomponenten auf den Uterus und die Fertilität der Stute 18
Harald Sieme, Doris Schoon, Magali Quetin, Erich Klug, Heinz-Adolf Schoon
Niedersächsisches Landgestüt Celle
Institut für Veterinär-Pathologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig
Klinik für Pferde der TiHo
3

4
Inhaltsverzeichnis
Qualitätsmanagement im Uterus: nur ausgewählte Spermien erreichen die Eizelle 21
Hans-Joachim Schuberth, Holm Zerbe, Hans-Wilhelm Michelmann, Peter Schwartz, Ulrike Taylor, Henning Wendt,
Antje Frenzel und Detlef Rath
Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Mariensee (FAL)
Arbeitsgruppe Immunologie der TiHo
Zentrum für Frauenheilkunde und Zentrum für Anatomie der Georg-August-Universität Göttingen
Hallo Herr Doktor, bitte ein Stutfohlen! 25
Detlef Rath, Harald Sieme, Heide Buss, Chis Maxwell
Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Mariensee, (FAL)
Niedersächsisches Landgestüt Celle
Veterinärfakultät der Universität Sydney
Die Zona pellucida: Schutz- und Kommunikationsorgan der Eizelle 28
Edda Töpfer-Petersen, Detlef Rath, Hans-Wilhelm Michelmann, Dorothee von Witzendorff, Mahnaz Ekhlasi-Hundrieser,
Peter Schwartz, Erik Piehler, Silja Ebeling, Christiane Hettel, Birgit Sieg, Petra Westermann
Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
Zur erfolgreichen Fortpflanzung von Wildschweinen 32
Friederike Gethöffer
Institut für Wildtierforschung der TiHo (Arbeitsgruppe Prof. Dr. Klaus Pohlmeyer, Dr. Gunter Sodeikat)
Genetische Ursachen der Wurfgröße beim Schwein 35
Andreas Spötter, Ottmar Distl
Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der TiHo
Einsatz der Farbdopplersonographie in der Gynäkologie des Rindes 39
Heinrich Bollwein, Kathrin Herzog, Sandra Schmauder, Ulrich Baumgartner, Detlef Rath und Heiner Niemann
Klinik für Rinder und Institut für Tierzucht der TiHo
Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Mariensee (FAL)
Zentrum für Frauenheilkunde und Zentrum für Anatomie der Georg-August-Universität Göttingen
Untersuchungen zu östrogen-bedingten-Störungen der Fertilität von Sauen
mittels eines Reportergen-Assays 42
Petra Winter, Alfonso Lampen, Tatjana Shobeiry, Dzmitry Karaljov, Charlotte Schröder, Karl-Heinz Waldmann,
Heinz Nau, Josef Kamphues
Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik der TiHo
Institut für Tierernährung der TiHo
Klinik für kleine Klauentiere und Forensische Medizin und Ambulatorische Klinik der TiHo
Assistierte Reproduktionstechniken und Epigenetik: Die neue Flexibilität in der Embryonalentwicklung 45
Christine Wrenzycki, Andrea Lucas-Hahn und Heiner Niemann
Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Mariensee (FAL), Forschungsbereich Biotechnologie
Assistierte Reproduktion bei Baumsteigerfröschen:
Ein veterinärmedizinischer Beitrag zur Erhaltung gefährdeter Tierarten 49
Christian Lipke, Sabine Meinecke-Tillmann, Burkhard Meinecke
Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo

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6
Dagmar Waberski
Forschung für die künstliche Besamung
Die Erfolgsstory darf nicht darüber hinwegtäuschen, dass es noch
immer viele ungelöste Fragestellungen in der Anwendung dieser Biotechnologie
gibt. Die Beantwortung dieser Fragen ist für die Wettbewerbsfähigkeit
einer modernen Tierproduktion grundlegend. Dazu
zählen beispielsweise die Verbesserung von Konservierungsverfahren,
die Möglichkeiten einer zuverlässigen Fertilitätsprognose durch
moderne spermatologische Untersuchungsmethoden und durch Invivo-Besamungsmodelle,
die Verbesserung des Besamungsmanagements
in der Herde sowie die Sicherstellung der Spermahygiene. Die
Grundlage für den Fortschritt auf diesen Gebieten ist stets das
zunehmende Verständnis der Physiologie der Befruchtung, aus dem
Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
Steigerung der Reproduktionseffizienz bei
landwirtschaftlichen Nutztieren
Zusammenfassung
Die Sicherstellung des Fortpflanzungserfolgs hat obere Priorität
in der landwirtschaftlichen Tierproduktion. Anders als in der
Humanmedizin ist dafür nicht das einfache Erreichen einer
Schwangerschaft entscheidend, sondern eine möglichst effiziente
Fortpflanzungsleistung der Einzeltiere und die der Herde. Dazu
wird bei Rind und Schwein zu etwa 80% die so genannte künstliche
Besamung eingesetzt: Konserviertes Sperma genetisch
wertvoller Vatertiere wird instrumentell in das Genital weiblicher
Zuchttiere eingebracht. Dort kommt es auf natürliche Weise zur
Befruchtung. Die Nachkommen werden in Zuchtprogrammen
wiederum auf ihren züchterischen Wert, Erbgesundheit und
Fruchtbarkeit getestet, so dass ein permanenter Zuchtfortschritt
erzielt wird. Die künstliche Besamung hat sich in den vergangenen
Jahrzehnten zu einer unerlässlichen und äußerst praktikablen
Biotechnologie entwickelt; so werden in Deutschland jährlich
etwa 4,8 Mio. Rinder und 5 Mio. Schweine besamt. Maßgeblich
für den Siegeszug der Besamung war und ist die Vermeidung der
Übertragung von Krankheiten, so dass die klassischen Deckseuchen
der Nachkriegsjahre heute der Vergangenheit angehören.
Abb. 1: Immunreaktion im Uterus:
Phagozytose von Spermien (Köpfe mit Pfeilen markiert) durch neutrophile
Granulozyten
Summary
High reproductive efficiency is the overall goal in farm animal production.
In contrast to human medicine, where the objective is a
single pregnancy in individual couples, in domestic farm animals
high fertility performance is required for entire herds. In cattle and
pigs, breeding is realized in about 80% of females by artificial
insemination. Preserved semen of genetically proven males is
introduced instrumentally into the female tract, where fertilization
occurs in a natural manner. Offspring are tested for their genetic
value, hereditary diseases, and fertility, thus ensuring ongoing
breeding progress. Artificial insemination has evolved into the
most important and reliable biotechnology in reproductive medicine.
In Germany, about 4.8 million cows and 5 million sows are
inseminated annually. The reason for the current widespread use
of artificial insemination lies in the elimination of genital infections,
which were the cause of severe economic loss in post-war years.
Nevertheless, numerous research issues remain to meet the
challenges of a modern, efficient animal production. Our growing
understanding of reproductive physiology can be applied to
develop reproductive strategies for use in artificial insemination.
This article presents four projects conducted at the Institute for
Reproductive Medicine with the aim of enhancing reproductive
performance in farm animals.
sich Gesetzmäßigkeiten für erfolgreiche Reproduktionsstrategien
ableiten lassen. Im Institut für Reproduktionsmedizin der Stiftung
Tierärztliche Hochschule werden in Kooperation mit den Mitgliedern
des Virtuellen Zentrums für Reproduktionsmedizin, mit Unterstützung
des Fördervereins Biotechnologieforschung e. V., der Besamungszuchtorganisationen
ZDS und ADR und der Deutschen Forschungsgemeinschaft
folgende Projekte zu diesen Gebieten bearbeitet:
1. Interaktion von Inseminat und dem Genital beim
weiblichen Schwein
Dagmar Waberski, Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
Hans-Joachim Schuberth, Arbeitsgruppe Immunologie der TiHo
Marion Hewicker-Trautwein, Institut für Pathologie der TiHo
Holm Zerbe, Ludwig-Maximilians-Universität München
Ronald H.F. Hunter, Edinburgh, UK
Spermien und das Sekret der akzessorischen Geschlechtsdrüsen
(Seminalplasma) interagieren auf vielfältige Weise mit dem weiblichen
Genitaltrakt. Ziel ist, dass befruchtungskompetente Spermien
zum richtigen Zeitpunkt an den Ort der Befruchtung, der Eileiterampulle,
gelangen. Das Seminalplasma der männlichen Geschlechtsdrüsen
beeinflusst beim Schwein den Ovulationszeitpunkt und den
Spermientransport im weiblichen Genital. Immunmodulatorische

Einflüsse auf den Uterus spielen eine große Rolle für die Spermienselektion
und die Entwicklungsmöglichkeit des jungen Embryos.
Die beteiligten aktiven Substanzen und Signaltransduktionswege
sind weitgehend unbekannt. Bekannt ist allerdings, dass beim
Schwein und einigen anderen Haussäugetieren effiziente lokale
Kommunikationswege zwischen Uterus, Eileiter und Ovar existieren,
an denen Lymph- und Blutgefäße mit charakteristischen
Gegenstrombahnen beteiligt sind. Mit Hilfe mikrochirurgischer
Methoden wurde der Versuch unternommen, uterine Lymphflüssigkeit
nach einseitiger „Besamung“ eines Uterushorns zu gewinnen
und zu analysieren. Zum Vergleich wurde ein Kontrolluterushorn mit
einem Placebo behandelt. Vergleichende immunhistochemische
Untersuchungen sollten mögliche lokale Einflüsse des Inseminats
aufzeigen. Die Analyse von Cytokinen und antigenpräsentierenden
Molekülen (MHC II Zellen) als Immunmodulatoren ergab einen signifikanten
Einfluss des Inseminats sowie regionale Unterschiede
zwischen Uterushorn und Uterushornspitze. Damit ist ein weiterer
Hinweis auf die lokale immunmodulatorische Wirksamkeit des
Samens gefunden worden, der bei der Feinsteuerung der sensiblen
Ereignisse unmittelbar vor der Befruchtung von Bedeutung sein
kann. Dieses Phänomen soll in zukünftigen Studien weiter charakterisiert
und beteiligte Substanzen identifiziert werden.
2. Besamungsmanagement in Sauenherden
Dagmar Waberski, Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
Horst Brandt, Justus-Liebig-Universität Gießen
Der falsche Besamungszeitpunkt gilt als Hauptursache für eine verminderte
Fruchtbarkeit (Subfertilität) im Sauenbestand. Im Gegensatz
zum Rind sind Brunstdauer und Ovulationszeitpunkt beim
Schwein variabel. So kommt es in der Praxis häufig zur Spermienalterung
im weiblichen Genital. Dafür verantwortlich sind zu lange
Intervalle zwischen Besamung und Ovulation oder, in selteneren
Fällen, eine verspätete Besamung. Obwohl seit längerem bekannt
ist, dass die Länge des Absetz-Brunstbeginn-Intervalls bestimmend
für den erwartenden Ovulationszeitpunkt ist, bereitet die Umsetzung
der Erkenntnisse Landwirten
und Tierärzten oft Schwierigkeiten.
Ziel dieses Projektes ist es, nach
einer sorgfältigen Anamnese von
Fruchtbarkeitsdaten und -management
betriebsspezifische Empfehlungen
für das Besamungsmanagement
zu erstellen. Wesentliches
Merkmal der Studie ist der Einsatz
einer ultraschallbasierten Ovardiagnostik
im Rahmen der Fruchtbarkeitsbetreuung
im Bestand. In sieben
ausgewählten Betrieben mit
Leistungsreserven im Fruchtbarkeitsbereich
wurde ein Konzept zur
Verbesserung des Besamungsmanagements
erprobt. Das Konzept
berücksichtigt die ökonomischen
Verhältnisse zwischen tierärztlicher
Betreuungsleistung und Verände-
rung der biologischen Leistung nach
Umsetzung der Besamungsempfeh-
Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
lung. Es zeigte sich, dass in allen Betrieben die Fruchtbarkeitsleistung
steigerbar war. Dies war mit erheblichen ökonomischen Vorteilen
für die Landwirte verbunden. Die tierärztliche Betreuungstätigkeit
war mit etwa 5% der Steigerung der direktkostenfreien Leistung
äußerst gering.
Die besondere Rolle der transkutanen Ovulationsdiagnostik wurde
in dieser Arbeit herausgestellt und ein Leitfaden für die Analyse des
Reproduktionsmanagements erstellt. Die Erkenntnisse werden in
Fortbildungsveranstaltungen an Besamungsorganisationen sowie
der in der Schweinebestandsbetreuung tätigen Tierärzteschaft und
Landwirte vermittelt.
3. Spermaqualität und Fruchtbarkeit bei
Rind und Schwein
Abb. 2: Ovarsonographie zur Feststellung des Ovulationszeitpunktes
in Sauenherden
Dagmar Waberski, Anna Petrunkina, Edda Töpfer-Petersen, Institut
für Reproduktionsmedizin der TiHo
Kooperation: Heinrich Bollwein, Klinik für Rinder der TiHo
Christine Wrenzycki, Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt
für Landwirtschaft (FAL)
Martin Beyerbach, Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung
der TiHo
Die Einschätzung der Spermienqualität bildet die Grundlage für eine
Fertilitätsprognose und ist somit unerlässlich für den gezielten Einsatz
von Zuchttieren. Weiter bildet sie die Grundlage für die Ermittlung
der von Tier zu Tier unterschiedlichen Anzahl an Spermien in
der Besamungsportion, die für einen Besamungserfolg vorhanden
sein müssen. Zudem ist die Erhebung qualitativer Spermienparameter
für eine Beurteilung und Entwicklung von Konservierungsverfahren
essentiell. Standardspermatologische Parameter, wie Motilität
und Morphologie sind für diese Zwecke unzureichend. Moderne
Ansätze beinhalten die Technik der Durchflusszytometrie (s. S. 39)
sowie die computergestützte Motilitätsanalyse.
In dem Projekt werden moderne spermatologische Techniken auf
ihre Eignung zur Fertilitätsdiagnostik
überprüft. Die Basis dafür bilden
reproduktionsphysiologische Erkenntnisse
zu den Mechanismen
der Volumenregulation von Spermien
und deren Bindungsfähigkeit
am Eileiterepithel. Für die Überprüfung
der Methoden werden In-vitro-
Modelle angewendet: z.B. der Oviduktexplant
Assay und In-vivo-
Besamungsmodelle wie dem Jungsauen-Modell
Hannover.
Das Forschungsgebiet bildet einen
Schwerpunkt der Arbeitsgruppe
und hat einen ausgeprägten interdisziplinären
Charakter. Spermienpopulationen
werden hinsichtlich
ihrer funktionellen und morphologischen
Eigenschaften präzise charakterisiert
und befruchtungsrelevante
Merkmale identifiziert. So ist
7

8
Abb. 3: Spermien im Eileiter des Schweins: Durch feste Bindung an das Eileiterepithel
wird das funktionelle Spermienreservoir gebildet.
die Fähigkeit von Spermien zur Volumenregulation eine wichtige
Voraussetzung zur Adaptation an unterschiedliche osmotische Verhältnisse
im Nebenhodenschwanz, Uterus und Eileiter und essentiell
für die Aufrechterhaltung der Spermienvitalität sowie für die
Induktion von Reifungsprozessen im weiblichen Genital (Kapazitation).
Unter In-vitro-Bedingungen wird die Fähigkeit von Spermienpopulationen
zur Osmoregulation erfasst und beteiligte Ionenkanäle
identifiziert. Interessanterweise sind bei Bullenspermien die
Fähigkeiten zur Volumenregulation und zur Bindung an das Oviduktepithel
miteinander assoziiert, wie In-vitro-Untersuchungen mit
dem Ovidukt Explant Assay zeigten. Die Bindung von Spermien an
das Eileiterepithel gilt als Voraussetzung für die Etablierung des
funktionellen Spermienreservoirs im weiblichen Genitaltrakt, das für
Selektion, Überleben und Reifung der Spermien verantwortlich ist.
Hierbei konnten die beteiligten Protein-Kohlenhydratstrukturen bei
verschiedenen Spezies identifiziert werden. Die Anzahl der befruchtungskompetenten
Spermien in diesem Spermienreservoir steht in
direkter Beziehung zum Befruchtungserfolg.
Spermienmembranen reagieren während der Spermakonservierung
empfindlich auf Lagerungs- und Temperatureinflüsse. Das
methodische Spektrum einer sensiblen Spermienqualitätsdiagnostik
ist daher der Schlüssel zur Entwicklung verbesserter Konservierungstechniken.
Die Ziele dabei sind die Reduzierung der Schäden
durch Tiefgefrierung bei Rindersperma und die Verlängerung der
Lagerungsfähigkeit flüssigkonservierter Eberspermien. Spermien
unterscheiden sich hinsichtlich Bau und Funktion hochgradig von
Körperzellen, aber nur graduell zwischen verschiedenen Tierarten,
so dass dieses Forschungsgebiet klassischerweise speziesübergreifend
bearbeitet wird und neben den landwirtschaftlichen Nutztieren
auch die Spezies Hund (Kooperation Anne-Rose Günzel-
Apel, Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo) und Pferd (Kooperation
Harald Sieme, Landgestüt Celle) beinhaltet. Eine besondere
Herausforderung stellt die Ermittlung der Beziehung zwischen spermatologischen
Parameter und der Fertilitätsleistung von Vatertieren
dar. Die Fruchtbarkeit ist das Resultat einer Vielzahl von Einflussfaktoren,
z.B. Besamungsmanagement und der Fertilität der weiblichen
Tiere, die in ihrer Summe den Einfluss der Spermaqualität
dominieren. Sorgfältig ausgearbeitete Versuchsdesigns mit In-vivo-
Modellen und Feldbesamungsversuchen, die Erhebung robuster
Fertilitätsdaten sowie solide statistische Analysen sind daher
Voraussetzung für eine erfolgreiche Bearbeitung der Fragestellung.
Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
4. Hygiene in der Spermaproduktion auf
Besamungsstationen
Dagmar Waberski, Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
Kooperation: Jens Seedorf, Institut für Tierhygiene der TiHo
Während seuchenhaft auftretende Genitalinfektionen durch Einführung
der künstlichen Besamung hierzulande ihren Schrecken verloren
haben, sind unspezifische Genitalinfektionen durch fakultativ
pathogene Keime nach wie vor von hoher Relevanz für den Reproduktionserfolg.
Insbesondere unter den Bedingungen des Natursprungs
gelangen nicht unwesentliche Mengen an Keimen in den
weiblichen Genitaltrakt. Der größte Teil dieser Keime wird durch körpereigene
Abwehrmechanismen inaktiviert oder ist unbedenklich für
die Gesundheit und Fruchtbarkeit des weiblichen Tieres. Anders ist
die Situation bei einer Schwächung des Immunsystems unter
Stressbedingungen oder bei der Übertragung obligat pathogener
Keime. Die Sicherstellung der Produktion mikrobiell unbedenklichen
Spermas ist daher von höchster Priorität für Besamungsstationen.
Da die Gewinnung keimfreien Spermas praktisch unmöglich ist,
müssen Strategien zur Keimminimierung entwickelt werden. Dazu
gehören die Absenkung der Temperatur, die Begrenzung der Lagerungsdauer
bei flüssigkonserviertem Sperma sowie der Zusatz von
Antibiotika zum Konservierungsmedium. In diesem Projekt wurden
der qualitative und der quantitative Keimstatus im Nativsamen und
im verdünnten Samen von Ebern einer repräsentativen Anzahl von
Besamungsstationen erhoben. Es wurden mögliche Keimeintragsquellen
während des Spermaverarbeitungsprozesses identifiziert
und Strategien zur Minimierung des Keimgehaltes entwickelt. Dies
beinhaltet neben der Anleitung zur Verbesserung räumlicher und
arbeitstechnischer Gegebenheiten die Entwicklung eines Hygienekontrollplans
für Spermalabors, der sich als Instrumentarium eines
Qualitätskontrollsystems eignet. Die Untersuchungen zeigten, dass
trotz der unvermeidbaren Kontamination des Spermas während der
Ejakulatgewinnung die Produktion keimfreien verdünnten Spermas
möglich ist.
Abb. 4: Flüssigkonserviertes Ebersperma (mit farblicher Markierung verschiedener
Eberrassen)

Die physiologische Situation
Klinik für Wiederkäuer der Ludwig-Maximilians-Universität München
Arbeitsgruppe Immunologie der TiHo
Holm Zerbe, Torge König, Hans-Joachim Schuberth, Wolfgang Leibold
Die gestresste Gebärmutter – Ursache für die
Gebärmutterentzündung bei der Kuh?
Zusammenfassung
Als Ursache für die Entstehung der beim Rind relativ häufigen
Gebärmutterentzündung (Endometritis) wird eine bisher nicht
geklärte Verringerung der Abwehrkapazität diskutiert. Es wird vermutet,
dass die neutrophilen Granulozyten, eine Subpopulation
der weißen Blutzellen, dafür verantwortlich sind. Ziel unserer Forschung
ist es, detaillierte Erkenntnisse über die Mechanismen zu
gewinnen, die bei der Entstehung einer Gebärmutterentzündung
eine Rolle spielen. Dieses Wissen ist Voraussetzung für die Erarbeitung
verbesserter Behandlungs- und Prophylaxekonzepte. Die
Forschungsarbeiten haben die Hypothese entkräftet, dass
Geburtsstress die Funktion der neutrophilen Granulozyten in der
Gebärmutter hemmt und so die Entstehung der Endometritis
begünstigt. Weiter konnte gezeigt werden, dass die Stoffwechselsituation
des Tieres sowie die Qualität, die Quantität einer bakteriellen
Kontamination in der Gebärmutter die Funktionalität der
Abwehrzellen stark beeinflussen.
Annähernd bei jeder Abkalbung kommt es beim Rind zu einer bakteriellen
Kontamination der Gebärmutter. Der erste Schutzwall
gegen bakterielle Verunreinigungen, die anatomischen Verschlussmechanismen
des Geburtsweges, ist während der Geburt außer
Kraft – der Geburtsweg ist weit geöffnet. Unter physiologischen
Bedingungen reinigt sich der Uterus trotzdem innerhalb von 10-14
Tagen selbst, so dass keine Keime mehr nachweisbar sind. Zu verdanken
ist das der zweiten, der immunologischen Abwehrlinie.
Diese wird v. a. durch die neutrophilen Granulozyten (Phagozyten =
„Fresszellen“) gebildet. Das gilt grundsätzlich für jede Körperregion
– auch für die Genitalorgane. Unter normalen Bedingungen sind die
neutrophilen Granulozyten, die in großer Anzahl in die Gebärmutterschleimhaut
und -höhle einwandern, in der Lage, die Bakterien
durch Phagozytose zu eliminieren.
Warum kommt es beim Rind trotzdem zur
Gebärmutterentzündung?
Oftmals versagt dieses Prinzip. Viele Rinder erkranken kurz nach
der Abkalbung an einer Gebärmutterentzündung. Meist handelt es
sich dabei um eine rein lokale Entzündung, die oft trotz Behandlung
über 7 bis 10 Tage, manchmal in chronischer Form über Wochen,
fortbesteht. In einigen Fällen ist die körpereigene Abwehr nicht in
der Lage, den Gesamtorganismus gegen die Keime und deren Toxine
zu schützen. Dann kann es zu zum Teil schweren Störungen des
Allgemeinbefindens des Tieres kommen. Die Erkrankung führt häufig
zu empfindlichen wirtschaftlichen Verlusten für den Landwirt.
Summary
Postpartum endometritis is a frequent disease in cows. One reason
for the development of endometritis seems to be a depression
of the functional capacity of neutrophilic granulocytes, a subpopulation
of white blood cells. The aim of our studies is to investigate
in detail the pathogenic mechanisms of this disease. This
knowledge is necessary to develop improved treatment regimens
for puerperal endometritis. In our experiments we could not confirm
the hypothesis that birth-associated stress leading to a
functional depression of neutrophilic granulocytes is responsible
for the development of endometritis in cows. However, it was
determined that metabolic and microbiological parameters were
responsible for the modulation of functional parameters of neutrophils.
Trotz umfangreicher Forschung auf diesem Gebiet gibt es in der
Literatur noch immer sehr unterschiedliche Auffassungen zu Ursachen,
Entstehung und Therapie der Gebärmutterentzündung beim
Rind. Behandelt wird die Erkrankung zurzeit mit Antibiotika und desinfizierenden
Lösungen. Allerdings ist diese Behandlung nicht
immer effizient und hat nachweislich negative Einflüsse auf das
lokale Abwehrgeschehen. Aus diesen Gründen wird nach Therapieformen
gesucht, die die Unterstützung körpereigener Abwehrmechanismen
zum Ziel haben. Neue Erkenntnisse zur Aktivität neutrophiler
Granulozyten im Zusammenhang mit der Entstehung und
Verhinderung der Endometritis sind von grundlegender Bedeutung
und könnten zu Verbesserungen der klinischen Diagnostik und
besonders der Therapie beitragen.
Die Granulozytenfunktionalität ist kurz nach der
Abkalbung inhibiert – wodurch?
Neutrophile Granulozyten, die schon in eine gesunde Gebärmutter
eingewandert sind, weisen im Vergleich zu aus dem Blut isolierten
Zellen eine geringere Vitalität und Phagozytosefähigkeit auf – und
dies sogar in Zeiten weitab von der allgemein als besonders kritisch
angesehenen geburtsnahen Phase. Außerdem weisen diese Zellen
eine deutlich verminderte Ausstattung mit funktionell wichtigen
Oberflächenrezeptoren auf. Allerdings scheinen die neutrophilen
Granulozyten aus der Gebärmutter Mikroorganismen ähnlich gut
abzutöten, wie neutrophile Granulozyten aus dem Blut.
Eigene Experimente haben gezeigt, dass bei Kühen die Abwehrkapazität
der neutrophilen Granulozyten im Blut kurz nach der Abkalbung
herabgesetzt ist. Dieses Defizit ist schon bei Kühen messbar,
die nicht klinisch erkranken. Auf der Suche nach den Ursachen, die
schließlich doch zur Erkrankung des Tieres führen, zeigte sich, dass
sich Störungen des Kohlenhydrat-Lipidstoffwechsels, die regelmäßig
9

10
Klinik für Wiederkäuer der Ludwig-Maximilians-Universität München
Arbeitsgruppe Immunologie der TiHo
Abb. 1: Während der Geburt (a) werden hohe Konzentrationen des körpereigenen
Stresshormons Kortisol im Blut gemessen. Ist diese als immunsuppressiv
bekannte Mediatorsubstanz für die Entstehung der Gebärmutterentzündung
(b – die Kuh zeigt entzündlichen Ausfluss) kurz nach der Geburt verantwortlich?
nach der Abkalbung auftreten, negativ auf die Abwehrkapazität neutrophiler
Granulozyten auswirken. Wir haben diese Zellen aus dem
Blut von Kühen mit Leberverfettung isoliert. Sie fallen im Vergleich zu
Zellen gesunder Kontrolltiere durch eine verringerte Rezeptordichte
fast aller von uns untersuchten Oberflächenstrukturen auf. Gleichzeitig
ist auch eine verringerte bakterizide Kapazität nachweisbar.
Bisher fehlten auch Untersuchungen über den Einfluss der Gebärmutterflora
auf die funktionellen Eigenschaften von neutrophilen
Granulozyten. Unsere Resultate belegen, dass die Schlüsselbakterien
der Gebärmutterentzündung beim Rind, Escherichia coli- und
Arcanobacterium pyogenes-Keime, in ganz ähnlicher Weise funktionelle
Parameter von neutrophilen Granulozyten modulieren können.
Ausgelöst werden die Veränderungen bei neutrophilen Granulozyten
durch den direkten Kontakt der Bakterien mit den Zellen.
Die Bakterien haben überwiegend negative Effekte auf die Leistungsfähigkeit
der Immunzellen. Dies könnte in einer dauerhaften
und starken Aktivierung der Zellen begründet sein, die eine funktionelle
Erschöpfung mit sich bringt. Außerdem deuten die Ergebnisse
daraufhin, dass E. coli und A. pyogenes zur unphysiologisch erhöhten
Anhäufung von neutrophilen Granulozyten im Entzündungsgebiet
beitragen und damit die Regulation der entzündlichen Prozesse
negativ beeinflussen.
Welchen Einfluss hat Stress auf die Funktionalität
von neutrophilen Granulozyten (PMN)?
a) b) c)
Die Kuh ist vor, während und nach der Geburt durch den Beginn der
Laktation, die Futterumstellung, das Umstallen in den Abkalbestall
und durch die Geburt selbst sowohl psychischem als auch physischem
Stress ausgesetzt. Hinzu kommt die körperliche und
schmerzhafte Belastung durch die Wehen.
Es ist bekannt, dass sowohl psychischer als auch physischer Stress
zu erhöhten Konzentrationen körpereigener Stresshormone, v. a.
des Kortisols, im Blutplasma führen. Diese vom Tier selbst produzierten
so genannten Glukokortikoide werden schon während der
Trächtigkeit, aber eben besonders im Zeitraum der Geburt vermehrt
produziert. Das Phänomen ist auch beim Menschen bekannt. Nachgewiesen
ist weiterhin, dass die physiologische Geburt beim Wiederkäuer
durch den Anstieg endogener Glukokortikoide eingeleitet
wird. Syntheseort der Glukokortikoide ist die Nebenniere der Frucht.
Eine holländische Forschungsgruppe hat zudem gezeigt, dass bei
Kuh und Ziege Stresshormone wie das Kortisol in Abhängigkeit von
der Stärke der Wehen vermehrt ausgeschüttet werden.
Exogene Glukokortikoide werden in Form von Medikamenten aufgrund
unterschiedlicher Indikationen eingesetzt. So wirken diese
Stoffe zum Beispiel stark entzündungshemmend; sie können beim
Rind aber auch zur Einleitung der Geburt eingesetzt werden. Eine
große Bedeutung wird der immunsuppressiven Wirkung sowohl der
exogenen als auch endogenen Glukokortikoide zugesprochen.
Durch die Schwächung der körpereigenen Abwehrkräfte sind Tiere
mit erhöhtem Glukokortikoid-Plasma-Spiegel anfällig gegenüber
unterschiedlichen Erkrankungen. Dieses Phänomen wurde vielfach
untersucht, gleichwohl sind die genauen Mechanismen, die dem
zugrunde liegen, bisher ungenügend erforscht.
Beim Rind sind verschiedene Wirkungen auf das Immunsystem
beschrieben. So haben Glukokortikoide Einfluss auf die Expression
von funktionell wichtigen Oberflächenstrukturen der Leukozyten
(weiße Blutzellen), wie z.B. Bindungsmoleküle. Es wurden Effekte
auf die Wanderungsfähigkeit, die Phagozytose (Fressaktivität), die
Bakterienabtötung durch Leukozyten aber auch auf Antikörper-Konzentrationen
im Blut und die Sekretion von verschiedenen immunologischen
Mediatorsubstanzen beobachtet. Dabei finden sich
durchaus auch widersprüchliche Resultate in der Literatur.
Abb. 2: L-Selectin ist ein Bindungsmolekül der neutrophilen Granulozyten, das einen Tag nach Applikation des Glukokortikoids Dexamethason schwächer an der Oberfläche
der Zellen exprimiert wird als bei unbehandelten Tieren (a). L-Selectin spielt bei der Bindung und beim so genannten „Rolling“ der Zellen an der Gefäßwand
und damit für ihre Auswanderung ins Entzündungsgebiet eine maßgebliche Rolle (b – Abbildung aus Kuby, Immunology, 4th ed.). In einem Endometritismodell wurde
allerdings gezeigt, dass die Einwanderung der neutrophilen Granulozyten in die Gebärmutter nach Dexamethasongabe sogar stärker erfolgt als bei Kontrolltieren (c).

Klinik für Wiederkäuer der Ludwig-Maximilians-Universität München
Arbeitsgruppe Immunologie der TiHo
Unsere Untersuchungen sollten nun zeigen, ob entsprechende Wirkungen
auch beim Rind im geburtsnahen Zeitraum vorhanden sind
und diese mit der Entstehung der Gebärmutterentzündung in
Zusammenhang gebracht werden können.
Zur Simulation von Geburtsstress wurde das synthetische Glukokortikoid
Dexamethason eingesetzt. Dieses gehört zu den am häufigsten
medizinisch genutzten Glukokortikoiden. Es wirkt deutlich
stärker entzündungshemmend als das endogene Kortisol. Da alle
Glukokortikoide über den gleichen Rezeptor innerhalb der Zelle wirken,
kann es auch zur Simulation der Effekte endogener Glukokortikoide
eingesetzt werden. Außerdem kam ein durch eine Kooperation
zwischen Forschern der Klinik für Rinder und der Arbeitsgruppe
Immunologie der TiHo entwickeltes Modell der akuten Gebärmutterentzündung
zur Anwendung. Es ermöglicht, neutrophile Granulozyten
unter definierten Bedingungen in den gesunden Uterus
„jungfräulicher“ Rinder zu locken, zu gewinnen und deren funktionelle
Kapazität zu untersuchen. Mit der Verabreichung des Chemokins
Interleukin 8 (IL-8) wird eine körpereigene Substanz verwendet,
die im Entzündungsgeschehen eine bedeutende Rolle spielt
und im Entzündungsmodell die Granulozyten in großer Anzahl in die
Gebärmutter lockt.
Um aber überhaupt in die Gebärmutter gelangen zu können, müssen
die im Blut zirkulierenden neutrophilen Granulozyten aus den
Blutgefäßen auswandern können. Dieser als Extravasation
bezeichnete Prozess setzt die Kontaktaufnahme der Zellen mit der
Innenauskleidung der Gefäße, dem Gefäßendothel, voraus. Vermittelt
wird dies durch Oberflächenrezeptoren (Adhäsine) wie L-Selektin.
Genau dieser Prozess könnte aber unter Stressbedingungen
gestört sein. Aus der Literatur war bekannt, dass es nach Glukokortikoid-Applikation
zur verminderten Expression von Adhäsionsmolekülen
wie dem L-Selektin kommt – beim Rind, aber auch beim Menschen.
Dieses Phänomen konnte in eigenen Experimenten reproduziert
werden. Deshalb war zu erwarten, dass bei Glukokortikoid-
behandelten Tieren weniger Zellen aus den Blutgefäßen in ein Entzündungsgebiet
migrieren als bei unbehandelten Tieren. Zu einer
Störung der Wanderung der Zellen in die Gebärmutter kam es allerdings
nicht: Einerseits steigerte die Applikation des Glukokortikoids
die Anzahl im Blut zirkulierender neutrophiler Granulozyten dramatisch,
was auch im physiologischen geburtsnahen Zeitraum zu verzeichnen
ist. Andererseits wurden bei diesen Tieren, im Vergleich
zu Placebo-behandelten Tieren, mehr vitale neutrophile Granulozyten
durch IL-8 in die Gebärmutter gelockt.
Allerdings vermindern Glukokortikoide die Produktion von so
genannten reaktiven Sauerstoffmetaboliten bei neutrophilen Granulozyten,
die in erster Linie als bakterizide Substanzen zu verstehen
sind. Da sie – im Übermaß produziert – auch zur Gewebszerstörung
führen können, ist noch nicht abschließend geklärt, ob es sich
hier um eine immunsuppressive Wirkung oder einen natürlichen
Eigenschutzmechanismus vor Gewebsschäden handelt. Dies fordert
weiterführende Forschungsaktivitäten.
Fazit
Diese Resultate – im Zusammenhang mit denen anderer Forschungsteams
– zeigen, dass stoffwechselassoziierte und mikrobiologische
Faktoren Einfluss auf Entstehung und Verlauf einer
puerperalen Endometritis haben können. Daraus sind praktische
Interpretationen und Konsequenzen ableitbar, die insbesondere
das angemessene Fütterungsmanagement und die strenge
Geburtshygiene betreffen. Die Resultate liefern weitere Beweise für
immunmodulierende Glukokortikoidwirkungen, jedoch nicht nur
immunsuppressiver, sondern auch immunprotektiver Art. So konnte
gezeigt werden, dass Glukokortikoide die Wanderung der neutrophilen
Granulozyten in die Gebärmutter nicht stören und damit nicht
zwangsläufig die Empfänglichkeit der Tiere für eine uterine bakterielle
Infektion erhöhen. Vielmehr begünstigen sie eine Akkumulation
von Granulozyten im Entzündungsgebiet.
11

12
Bettina Zingrebe, Melanie Köllmann, Erich Klug
Endogene Androgene
Die wichtigsten körpereigenen Androgene sind neben Testosteron
5-alpha Dihydrotestosteron sowie Dehydroepiandrostenon und 4-
Androsten-3,17-dion. Hauptsyntheseort der endogenen Androgene
sind neben der Nebennierenrinde und dem Ovar vor allem die Leydigschen
Zwischenzellen des Hodens. Das beim Mann 90% der
körpereigenen Androgene ausmachende Testosteron wird in den
meisten Geweben durch ein Enzym erst in das eigentlich wirksame
5-alpha Dihydrotestosteron umgewandelt.
Wirkung von Androgenen
Sexualunspezifische Wirkungen
- Zunahme der Muskelmasse durch erhöhte Stickstoffretention,
damit einher geht eine proteinanabole Wirkung
- Zunahme des Körpergewichts
- Vermehrtes Knochenwachstum durch verstärkte Kalzium-Einlagerung
(Zunahme der Knochendicke und vermehrtes Längenwachstum,
insbesondere der Röhrenknochen beim juvenilen Tier)
- Anregung der Erythropoese
- Verstärkte Mukopolysacharidsynthese
- Regulation der Funktion der Talgdrüsen, sowie Auswirkungen auf
die Beschaffenheit der Haut
- gesenkter Blutspiegel von Cholesterol, freien Fettsäuren, Triglyceriden
und Phospholipiden
- „psychische Effekte“ wie Appetitsteigerung, vermehrte Aggressivität
und „will to win“
sexualspezifische Wirkungen
- Ausprägung der primären und sekundären Geschlechtsmerkmale
Therapeutisch kommen Androgene in der Humanmedizin bei Hypogonadismus,
zur generellen Stoffwechselanregung in Rekonvaleszenzphasen,
nach schweren Operationen oder auch zur Appetitsteigerung
und bei Muskeldystrophie zum Einsatz.
Klinik für Pferde der TiHo
Detektion und Auswirkungen anabol wirksamer
Substanzen an peripubertären Pferdehengsten
Zusammenfassung
Die so genannten Anabolika sind (halb)synthetische Verwandte
des androgenen Steroids Testosteron. Um ihre Bedeutung bei der
missbräuchlichen Anwendung im Leistungssport bei Mensch und
Tier sowie in der Aufzucht von Tieren verstehen zu können, ist
zunächst ein Exkurs in die Pharmakologie des Testosterons
notwendig. Aus diesem Kontext erklären sich auch die negativen
Auswirkungen, die hier in den Vordergrund gestellt werden sollen.
Summary
Anabolic drugs are (semi-)synthetic derivates of the androgenic
steroid testosterone. Thorough knowledge of the pharmacology
of testosterone is required both for better understanding of the
relevance of anabolic drugs in drug abuse in high-level sports in
both humans and animals as well as for the breeding and care of
equine athletes. This knowledge will make it possible to explain
the negative side effects of anabolic drugs.
Infolge der (therapeutischen) Anwendung von Androgenen wurden
jedoch auch Nebenwirkungen wie ein frühzeitiger Epiphysenschluss
beim Heranwachsenden, Leberfunktionsstörungen, Maskulinisierungssyndrom
bei Frauen sowie eine Hemmung der Partialfunktion
der Hypophyse mit Störungen der Hodenfunktion (Verringerung
der Spermatozoenzahl, -qualität und -beweglichkeit, Reduktion
der Hodengröße) festgestellt.
Abb. 1: Strukturformel von Testosteron und einigen im Pferdesport verbotenerweise
eingesetzten anabolen Steroiden

Abb. 2: Schema eines durch Applikation eines GnRH-Analogons stimulierbaren
Testosteronbasalwertes im Gegensatz zu einem niedrigen, nicht stimulierbaren
Testosteronwert eines Hengstes durch Anabolika-Einsatz (aus Untersuchungen
der Klinik für Pferde, TiHo Hannover ermittelt, bislang unveröffentlicht)
Anabolika, anabole Steroide und Doping
Besonders die anabolen (griechisch: ana: auf, ballein: werfen, etwa:
den Aufbaustoffwechsel fördernder Wirkstoff) Effekte der Androgene
sind es, die schon in den 1950er Jahren zum Einsatz dieser Hormone
bei Hochleistungssportlern geführt haben. Schon kurze Zeit
später war der Einsatz auch in der Aufzucht von Masttieren nicht
unüblich und wurde vermehrt im Pferdespring- und Rennsport eingesetzt.
Durch unterschiedliche chemische Modifikationen am Testosteronmolekül,
die insbesondere die androgenen Nebenwirkungen
der Stoffe reduzieren sollten, wurde die Stoffgruppe der
(halb)synthetischen Steroide oder Anabolika „geboren“.
Trotz des Verbots anabole Steroide bei Tieren, die der Fleischgewinnung
dienen, einzusetzen sowie die Aufnahme dieser Stoffe in
die Dopinglisten der Pferdesportverbände, zeigte sich in jüngster
Zeit, dass der Einsatz von Anabolika nicht nur im Pferdeleistungssport
ein ernst zu nehmendes Problem darstellt. Auch in der Pferdezucht,
insbesondere in der Jungpferdeaufzucht in Vorbereitung
auf den Verkauf oder Auktionen, hat der Einsatz der verbotenen
Stoffe Einzug gehalten. Die drei- bis vierjährig zum Verkauf angebotenen
Tiere sollen zu diesem Zeitpunkt einen möglichst weit entwickelten
Eindruck erwecken. Dazu werden den Tieren anabol wirkende
Substanzen verabreicht. Der Einsatz der Substanzen erfolgt
vom Absetzen bis zu einem Zeitpunkt vor dem möglichen Verkauf.
Unabhängig von den Bestimmungen der einzelnen Pferdesportverbände,
die auf sportethischen Gedanken beruhen, ist Doping auch
im Tierschutzgesetz selbst geregelt (TIERSCHUTZGESETZ 1998).
Dort heißt es in § 3: Es ist verboten, 5. ein Tier auszubilden, sofern
damit erhebliche Schmerzen, Leiden oder Schäden für das Tier verbunden
sind, 11. an einem Tier bei sportlichen Wettkämpfen oder
ähnlichen Veranstaltungen Dopingmittel anzuwenden. Nicht zuletzt
ist es auch seit 1998 nach § 6a des Arzneimittelgesetzes ausdrücklich
verboten, Arzneimittel zu Dopingzwecken im Sport in den Verkehr
zu bringen, zu verschreiben oder anzuwenden (ARZNEIMIT-
TELGESETZ 1976).
Durch die Entwicklung anaboler Steroide sollte eine Reduktion der
androgenen Wirkung erzielt werden. Eine vollkommene Trennung
der anabolen von der androgenen Wirkungskomponente gelang
Klinik für Pferde der TiHo
jedoch bei den anabolen Steroiden nicht, so dass oben erwähnte
Nebenwirkungen auch bei einem Einsatz von Anabolika bei Pferden
auftreten.
Anabole Steroide beim Junghengst
Auch bei Junghengsten zeigte die Anwendung anaboler Steroide in
Form von androgenen Nebenwirkungen deutlich negative Folgen:
Es konnten in mehreren Studien neben einer starken Reduktion des
Hodenumfanges und -gewichtes eine signifikante Abnahme der LH-
Konzentration (Luteinisierendes Hormon) im Serum durch negative
Rückkopplung zur Hypophyse sowie eine stark herabgesetzte
Samenqualität nachgewiesen werden.
Nach den bisherigen Erfahrungen in der Klinik für Pferde der TiHo
werden gehäuft Junghengste zur Zuchttauglichkeitsuntersuchung
vorgestellt, die durch eine verminderte Befruchtungsleistung auffallen.
Bei diesen Junghengsten steht oftmals eine Mikrorchie, einhergehend
mit einer verminderten Samenbeschaffenheit (Dysspermie)
im Vordergrund der abweichenden Befunde. In den meisten der hier
beschriebenen Fälle kann die Ursache für diese Symptome mit Hilfe
der bisherigen andrologischen Untersuchungsmethoden nicht festgestellt
werden.
Im Zusammenhang mit Symptomen wie Hodendegeneration bzw.
Hypoplasie wird häufig ihre Ätiologie diskutiert. Als mögliche Ursache
für diese Befunde wird in der Literatur die Anwendung von anabolwirksamen
Steroiden angegeben. Bislang konnte diese Vermutung
aber noch nicht eindeutig verifiziert werden. Da vermutet wird,
dass anabole Steroide auch in der Pferdepraxis und in der Hengstaufzucht
eingesetzt werden, und beim Menschen die negative Wirkung
der Anabolika auf die Fertilität beschrieben wurde, werden von
den Ergebnissen der hier vorgestellten Studie grundlegende Daten
für die andrologische Bewertung und Prognose von Hengsten, die
neu in der Zucht eingesetzt werden, erwartet.
In der geplanten wissenschaftlichen Arbeit soll durch gezielte und
kontrollierte Anabolika-Verabreichung der Effekt der Substanzen
auf Hodengröße und -gewicht ermittelt werden. Weiter soll das
ultrasonographische Erscheinungsbild der Hoden mit der Graustu-
Abb. 3: Foto eines Junghengstes mit Mikrorchie
(Klinik für Pferde, TiHo Hannover)
13

fenanalyse betrachtet werden und
endokrinologische Regelmechanismen
sowie histologische Veränderungen im
Hodenparenchym durch Hodenbiopsien
an einer Versuchs- und einer Kontrollgruppe
von Junghengsten ermittelt
werden.
Die Hodenmaße (Gewicht und Größe)
wurden bislang in allen durchgeführten
Studien durch die einseitige Kastration
der Tiere ermittelt. Die Spermiogeneseleistung
wurde in histologischen Untersuchungen
an den kastrierten Hoden
oder mittels Ejakulatgewinnung durchgeführt.
Die Methode der Kastration ist
nur für wissenschaftliche Studien praktikabel,
zur Diagnosefindung in der
Praxis und Untersuchung am Zuchthengst
allerdings ungeeignet.
Ein Ziel der Arbeit ist es, die Darstellung der histologischen Befunde,
die in früheren Studien mittels einseitiger Kastration erfolgten
anhand von repräsentativen Biopsien zu evaluieren und so eine differenzierte
Bewertung der Spermiogeneseleistung auch am Zuchthengst
zu ermöglichen.
Klinik für Pferde der TiHo
Weiterhin soll ein eindeutiger
Zusammenhang zwischen
Detektion der Substanzen
und klinisch-histologischen
Abweichungen durch eine an
der Stiftung Tierärztliche
Hochschule Hannover etablierte
(SCHLUPP) Haarproben-Analysen
erbracht werden.
Nur durch eine enge
Zusammenarbeit mit dem
Institut für Veterinär-Pathologie
der Veterinärmedizinischen
Fakultät der Universität
Leipzig (Heinz-Adolf
Schoon), dem Institut für
Chemische Analytik und
Endokrinologie der TiHo
Abb. 4: Ultrasonogramm eines mikrorchen Hodens, diffuse hyperechogene
Bereiche im Hodenparenchym (Klinik für Pferde, TiHo Hannover) (Hans-Otto Hoppen) und dem
Institut für Dopinganalytik und
Sportbiochemie in Kreischa
(Rudhard Klaus Müller) ist es möglich die Ergebnisse aus verschiedenen
Blickrichtungen zu beleuchten und damit durch eine Harmonisierung
der verschiedenen Fachrichtungen zu einer gemeinsamen
Bewertung der Befunde von subfertilen Junghengsten mit dem
Verdacht auf anabolikabedingte Subfertilität zu kommen.
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Ablauf der Befruchtung
Damit ein Hengst erfolgreich in der Zucht eingesetzt werden kann,
muss er neben anderen Voraussetzungen natürlich fruchtbar sein.
Für eine erfolgreiche Fortpflanzung muss der Hengst hierzu
zunächst korrekt ausgebildete Hoden aufweisen, in denen die frühen
Schritte der Spermienproduktion ablaufen (Abb. 1). In den
Samenkanälchen der Hoden befinden sich die Vorläuferzellen für
die Spermienproduktion, die so genannten Spermatogonien, die
noch, genauso wie fast alle anderen Körperzellen, einen doppelten
Satz an Erbanlagen aufweisen (diploide Zellen). Für die Spermienproduktion
werden aus den relativ wenigen Spermatogonien durch
Zellteilung ständig große Mengen an Spermatocyten, welche über
cytoplasmatische Brücken untereinander verbunden sind, gebildet.
In den zwei Teilungsschritten der Meiose werden aus den Spermatocyten
die so genannten Spermatiden gebildet. Spermatide sind
kleine runde Zellen, die anders als die Spermatogonien oder Spermatocyten
nur noch einen einfachen Satz an Erbanlagen tragen.
Dies ist charakteristisch für Keimzellen (haploide Zellen). Ebenfalls
noch im Hoden differenzieren die Spermatiden zu Spermien aus.
Dabei wird die DNA der Spermien mit besonderen Schutzproteinen
extrem dicht verpackt und die charakteristische Morphologie der
Spermien mit Kopf, Mittelstück und Schwanz bildet sich aus. Am
Ende dieser Differenzierungsprozesse im Hoden sind die Spermien
aber immer noch unbeweglich und unter natürlichen Bedingungen
nicht in der Lage, eine Eizelle zu befruchten. Die Spermien werden
schließlich vom Hoden in den Nebenhoden transportiert, wo die
Spermienreifung stattfindet und die Spermien ihre Befruchtungsfähigkeit
erlangen. Bei der Passage durch den Nebenhoden verändert
sich unter anderem die Zusammensetzung der Spermienhülle.
Zu diesen Veränderungen gehört die Bindung verschiedener vom
Nebenhoden sezernierter Proteinen an die Spermienoberfläche.
Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der TiHo
Niedersächsisches Landgestüt Celle
Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
Tosso Leeb, Rony Jude, Henning Hamann, Ottmar Distl, Harald Sieme, Edda Töpfer-Petersen
Molekulargenetische Untersuchungen zur
Fruchtbarkeit von Hengsten
Zusammenfassung
Die Fruchtbarkeit von Hengsten wird durch ein komplexes
Zusammenspiel aus Umweltfaktoren und genetischen Einflüssen
bestimmt. Die zunehmende Verbreitung der künstlichen
Besamung in der Warmblutzucht führt zu einer Reduktion der
Anzahl der Zuchthengste und gleichzeitig zu einer Reduktion der
umweltbedingten Schwankungen der Hengstfruchtbarkeit.
Dadurch werden nun auch Untersuchungen zur Genetik der
Hengstfruchtbarkeit möglich. In einem aktuellen Projekt werden
Gene für die CRISP Proteine, einer Hauptkomponente des Seminalplasmas
von Hengsten, untersucht. Dabei wird analysiert,
ob bestimmte Genvarianten mit einer besonders hohen oder
niedrigen Reproduktionsleistung korrelieren.
Summary
Stallion fertility is influenced by complex interactions between
environmental and genetic factors. The increasing use of artificial
insemination in the breeding of riding horses leads to a decrease
in the number of breeding stallions and simultaneously to a
reduction in the environmentally caused variance in stallion fertility.
These developments facilitate the analysis of the genetic
determinants of stallion fertility. The genes for CRISP proteins are
the focus of a current research project. CRISP proteins represent
a major fraction of stallion seminal plasma. This project investigates
whether specific genetic variants are correlated with high or
low reproductive performance.
Genetik der Fruchtbarkeit
Insbesondere durch Untersuchungen an Menschen und Mäusen
sind heute weit über hundert genetische Mechanismen bekannt, die
die Fruchtbarkeit beeinflussen. Hierzu zählen genetische Veränderungen,
die ganze Chromosomen betreffen, wie z.B. das Klinefelter
Syndrom, bei dem zwei X-Chromosomen und ein Y-Chromosom in
den Zellen vorliegen (XXY) oder das Turner Syndrom, bei dem nur
ein X-Chromosom in allen Zellen vorhanden ist (X0). Solche Chromosomenanomalien
beeinträchtigen die korrekte Verteilung der
Chromosomen während der Meiose und führen daher im Allgemeinen
zur vollständigen Unfruchtbarkeit.
Ebenso sind zahlreiche Mutationen einzelner Gene bekannt, die
frühe Schritte der Geschlechtsentwicklung oder der Spermienproduktion
beeinträchtigen, und die typischerweise ebenfalls zur vollständigen
Unfruchtbarkeit führen. Beispielsweise führen Mutationen
im Gen für den Androgenrezeptor, welcher die Wirkung des männlichen
Geschlechtshormons Testosteron vermittelt, zur so genannten
testikulären Feminisierung. Hengste, die eine derartige Mutation
tragen, entwickeln die äußeren Geschlechtsmerkmale einer
Stute, weisen jedoch Hoden in der Bauchhöhle auf. Diese Pferde,
die zunächst für Stuten gehalten werden, sind unfruchtbar und weisen
ein hengsttypisches aggressives Verhalten auf, das durch die
chirurgische Entfernung der Hoden korrigiert werden kann.
In der Pferdezucht gilt das Interesse neben den genetischen
Mechanismen, die zur Unfruchtbarkeit führen, vor allem jenen
genetischen Variationen, die bei grundsätzlich fertilen Hengsten zu
quantitativen Schwankungen in der Reproduktionsleistung führen.
Der zunehmende Einsatz der künstlichen Besamung führt dazu,
dass relativ wenige Hengste, die ohne Berücksichtigung ihrer
Fruchtbarkeitsleistung, ausschließlich aufgrund ihres Exterieurs
und ihrer Leistung im Reitsport selektiert werden, sehr intensiv in
15

16
der Zucht genutzt werden und sehr viele Nachkommen bekommen
(Abb. 2). Natürlich möchte man aber nur solche Hengste für die
künstliche Besamung einsetzen, die uneingeschränkt fertil sind und
eine gleichmäßig hohe Spermienqualität aufweisen. Im Vergleich zu
anderen Nutztierarten weisen die Erfolgsraten der künstlichen
Besamung bei Pferden große Schwankungen auf und sind deutlich
schlechter als zum Beispiel bei Rindern oder Schweinen.
Es ist für die Pferdezucht von erheblicher wirtschaftlicher Bedeutung,
wenn aus dem Sperma eines Spitzenhengstes möglichst viele
Spermaportionen für die künstliche Besamung gewonnen werden
können, d.h. es wird versucht, die Anzahl der Spermien pro Spermaportion
möglichst niedrig einzustellen. Gerade im Zuge dieser
Entwicklung zeigt sich jedoch, dass es bei verschiedenen Hengsten
Schwankungen in den Befruchtungsfähigkeiten der Spermien gibt.
Diese Unterschiede fallen bei natürlichen Bedeckungen nicht so
sehr ins Gewicht, da der Hengst beim Natursprung eine sehr große
Anzahl von Spermien auf die Stute überträgt, so dass die hohe
Menge an Spermien kleinere Beeinträchtigungen der Spermienqualität
kompensieren kann. Es kann daher passieren, dass ein Hengst
Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der TiHo
Niedersächsisches Landgestüt Celle
Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
Abb. 1: Schematische Darstellung der Abläufe bei der Differenzierung von Spermien im männlichen
Geschlechtsapparat. Im Hoden befinden sich mit den Spermatogonien die Stammzellen der Spermienproduktion.
Durch mitotische Zellteilungen entstehen aus den Spermatogonien Spermatocyten, welche über
cytoplasmatische Brücken verbunden bleiben. Nach der Meiose, bei der aus jedem Spermatocyt insgesamt
vier Spermatiden entstehen, enthalten die Zellen nur noch einen haploiden Satz an Chromosomen. Immer
noch im Hoden differenzieren die Spermatide zu unreifen Spermien, welche in den Nebenhoden transportiert
werden. Dort und bei der weiteren Passage durch den Genitaltrakt lagern sich Proteine aus dem Seminalplasma
an die Spermienoberfläche, welche zur Spermienreifung beitragen und somit eine wichtige Rolle
für die Befruchtungsfähigkeit spielen. Im rechten Teil der Abbildung sind einige der über 100 Gene aufgelistet,
von denen man heute weiß, dass sie für die männliche Fruchtbarkeit wichtig sind.
im Natursprung eine völlig normale Fruchtbarkeit
zeigt und erst bei seinem Einsatz in
der künstlichen Besamung unterdurchschnittliche
Befruchtungserfolge verzeichnet
werden. Neben der Anzahl der Spermien
haben unter den Bedingungen der Samenübertragung
insbesondere auch die Spermienalterung
und die Konfektionsform
(Frisch-, Tiefgefriersperma) einen wichtigen
Einfluss auf das Fertilitätsergebnis. Aufgrund
der zunehmenden Bedeutung der Spermaqualität
in der künstlichen Besamung
erscheint es besonders wichtig, in Ergänzung
zu modernen spermatologisch-diagnostischen
Verfahren auch genetische
Mechanismen zu untersuchen, die einen
Einfluss auf die Befruchtungsfähigkeit von
Hengstsperma haben.
Untersuchung der CRISP Gene
In dem Forschungsprojekt, das gemeinsam
vom Institut für Reproduktionsmedizin, dem
Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung
und dem Landgestüt Celle durchgeführt
wird, ist die systematische Untersuchung
von fortpflanzungsrelevanten Genen
geplant. Derzeit konzentrieren sich die
Untersuchungen dabei vor allem auf Gene,
die die Spermienreifung und die Wechselwirkungen
der Spermien mit dem weiblichen
Genitaltrakt beeinflussen. Hierzu werden am
Institut für Reproduktionsmedizin Proteine
aus der Spermaflüssigkeit isoliert und biochemisch
charakterisiert. Nach der biochemischen
Charakterisierung der isolierten
Proteine beginnt die molekularbiologische
Charakterisierung der zugehörigen Gene.
Abb. 2: Gewinnung von Samen für die künstliche Besamung von einem Hengst.
Der Hengst springt auf ein so genanntes Phantom, welches die charakteristische
Silhouette einer Stute aufweist. Ein Besamungstechniker benutzt eine künstliche
Scheide, um den Samen aufzufangen. Der gewonnene Samen wird anschließend
spermatologisch untersucht, mit Verdünner auf eine definierte Spermienkonzentration
eingestellt und in Portionen für die künstliche Besamung aufgeteilt.

Hierfür werden die mRNA-Moleküle für die Proteine entschlüsselt.
Die Kenntnis der mRNA-Sequenz ist dann wiederum der Ausgangspunkt
für die Bestimmung der genomischen DNA-Sequenz der
zugehörigen Gene, welche am Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung
durchgeführt wird. Am Ende dieser drei ersten
Schritte liegen somit Daten über die untersuchten Gene auf DNA-,
mRNA-, und Proteinebene vor.
Die ersten Gene, die von uns auf diese umfassende Weise charakterisiert
wurden, waren die Gene für die Cystein-reichen sekretorischen
Proteine (CRISP) beim Pferd. Unsere Untersuchungen ergaben,
dass das Pferd zwar genauso wie der Mensch oder die Maus
drei CRISP Gene besitzt. Im Gegensatz zu allen anderen bisher
untersuchten Säugetierarten bildet der Hengst jedoch sehr große
Mengen des CRISP3 Proteins in den akzessorischen Geschlechtsdrüsen.
Dies könnte ein erster Hinweis auf eine besondere tierartspezifische
Funktion von CRISP3 beim Pferd sein. Die Beobachtung,
dass auf der Oberfläche der Spermien eines subfertilen
Hengstes deutlich weniger CRISP Proteine zu finden waren als auf
den Spermien von normal fertilen Hengsten, ist ein weiteres Indiz
für die mögliche Bedeutung der CRISP Proteine im Befruchtungsgeschehen.
Inzwischen wurden die DNA-Sequenzen der drei CRISP Gene von
über 100 Hengsten des Niedersächsischen Landgestüts Celle
untersucht. Dabei zeigte sich im Vergleich zu anderen Genen eine
besonders hohe Variabilität der CRISP Gene. Insgesamt konnten in
den drei CRISP Genen etwa 100 Sequenzvariationen aufgespürt
werden, von denen sechs auch Veränderungen in den Proteinsequenzen
der CRISP Proteine bewirken (Abb. 3).
Im nächsten Schritt des Projekts wird derzeit untersucht, ob die
gefundenen Variationen in den CRISP Genen mit der Spermaqualität
in Zusammenhang stehen. Hierzu werden die oben erwähnten
DNA-Sequenzen der CRISP Gene von Besamungshengsten des
Niedersächsischen Landgestüts bestimmt (Genotyp). Gleichzeitig
werden von diesen Hengsten die Daten über alle Bedeckungen
inerhalb von sechs Jahren ausgewertet, um einen Anhaltspunkt
über die Besamungserfolge der einzelnen Hengste zu gewinnen
(Phänotyp). Im Rahmen einer Assoziationsstudie werden dann
Genotyp und Phänotyp der Hengste verglichen und es wird untersucht,
ob bestimmte genetische Varianten der CRISP Gene gehäuft
bei Hengsten mit besonders guten oder schlechten Besamungsergebnissen
auftreten. Erste Ergebnisse unserer Arbeiten deuten
inzwischen tatsächlich darauf hin, dass bestimmte Varianten der
CRISP Gene die Hengstfertilität beeinflussen. Sollten sich diese
vorläufigen Ergebnisse bestätigen, so könnte ein Gentest entwickelt
werden, der die Beurteilung der Spermaqualität von Hengsten verbessern
wird. Ein großer Vorteil eines solchen Gentests besteht
darin, dass der Test schon beim Fohlen durchgeführt werden kann
und man nicht erst die Geschlechtsreife oder gar den Zuchteinsatz
eines Hengstes abwarten muss.
Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der TiHo
Niedersächsisches Landgestüt Celle
Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
Abb. 3: Genotypisierung von Hengsten an einer DNA-Sequenzvariation. (A)
Schematische Darstellung des Nachweisverfahrens. Der Test dient dazu, die
DNA-Sequenz einer vorher bekannten variablen Stelle zu bestimmen. In dem
konkreten Beispiel ist ein DNA-Ausschnitt eines Hengstes dargestellt, bei dem
an einer Position entweder der Baustein A oder der Baustein G stehen kann.
Falls die variable Position ein A ist, enthält die Sequenz an dieser Stelle eine
Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym DdeI, welches DNA an bestimmten
Erkennungssequenzen zerschneidet. Falls an der variablen Stelle der Baustein
G steht, dann entspricht die Sequenz in diesem Bereich nicht der DdeI
Erkennungssequenz. Etwas weiter rechts von dieser fakultativen DdeI Erkennungssequenz
befindet sich noch eine konstitutive Schnittstelle für DdeI, die bei
allen Pferden immer konstant vorhanden ist. Zur Bestimmung des Genotyps wird
ein 300 Basenpaare (300 bp) langes DNA-Fragment mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion
(PCR) selektiv vermehrt und anschließend mit dem Restriktionsenzym
DdeI gespalten. Die zwei verschiedenen Allele ergeben dabei unterschiedliche
Fragmentmuster, die schematisch angedeutet sind. (B) Darstellung
eines Agarosegels, bei dem nach einer Gelelektrophorese die DNA-Fragmente
des Experiments ihrer Größe nach aufgetrennt wurden. In den vier Spuren (1-4)
sind vier verschiedene Hengste untersucht worden. Anhand der unterschiedlichen
Bandenmuster lässt sich der Genotyp eindeutig zuordnen (A/A – homozygot
A; A/G – heterozygot A/G; G/G – homozygot G).
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Niedersächsisches Landgestüt Celle
Institut für Veterinär-Pathologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig
Klinik für Pferde der TiHo
Harald Sieme, Doris Schoon, Magali Quetin, Erich Klug, Heinz-Adolf Schoon
Einfluss von Inseminatkomponenten auf den
Uterus und die Fertilität der Stute
Zusammenfassung
Jede Bedeckung oder Besamung hat, vermittelt durch komplexe
Interaktionen zwischen zellulärer und humoraler Immunantwort
(neutrophile Granulozyten, Immunglobuline, Komplement) sowie
mechanischer Clearance (myometriale Kontraktionen) eine physiologische
transiente Endometritis bei der Stute zur Folge. Die
Bedeutung dieses Entzündungsgeschehens für das Fertilitätsergebnis
wird kontrovers diskutiert.
Der Einfluss isolierter Inseminatkomponenten (Spermien, Seminalplasma,
Verdünner) nach intrauteriner Applikation auf das
Auftreten von neutrophilen Granulozyten und weiterer Entzündungszellen,
wie Makrophagen, Lymphozyten, Plasmazellen,
eosinophile Granulozyten und Mastzellen, wurde in einem
aktuellen Projekt anhand von Endometriumbioptaten östrischer
Stuten erfasst. Im Ergebnis waren die Einzelkomponenten des
Inseminates, bezogen auf die Zelldichte der neutrophilen Granulozyten,
IgA-produzierender Plasmazellen und Makrophagen
graduell und temporär unterschiedlich am Entzündungsgeschehen
beteiligt. Die gewonnenen Erkenntnisse werden hinsichtlich
der Ätiopathogenese und Bedeutung für das Fertilitätsergebnis
erläutert.
Vorgänge im Genitaltrakt der Stute nach
Bedeckung/Besamung
Damit eine erfolgreiche Vereinigung der Gameten im Eileiter stattfinden
kann, muss vorher eine Reihe von Prozessen in einer präzise
abgestimmten, zeitlichen Reihenfolge ablaufen. Neben der
Anzahl befruchtungspotenter Spermien werden in diesem Zusammenhang
der Bedeckungs-/Inseminationszeitpunkt, die -frequenz
und das -intervall als wesentliche, limitierende Faktoren hinsichtlich
des Befruchtungserfolges angesehen. Die Überlebensdauer männlicher
Gameten im Genitaltrakt der Stute variiert sehr deutlich zwischen
den Hengsten (24 Stunden - 6 Tage). Die Lebensdauer der
Eizelle hingegen nimmt mit zunehmendem Abstand zur Ovulation
kontinuierlich ab. In den Gebärmutterkörper eingebrachte Spermien
erreichen schon nach relativ kurzer Zeit die Uterushornspitze und
stehen in einer spezifischen Anordnung zu den epithelialen Strukturen
der uterotubalen Verbindung. Deutlicher als durch die individuelle
Progressivität der Spermien wird die Verteilung im weiblichen
Genitale jedoch durch eine Uterusmotilitätssteigerung im Zuge der
Interaktion mit dem Inseminat beeinflusst. Der Spermientransport
gilt 4 Stunden nach Bedeckung oder Besamung als abgeschlossen.
Nach erfolgreicher Befruchtung gelangt der Embryo ~6 Tage post
ovulationem in die Gebärmutter.
Summary
In the mare, breeding, whether natural or artificial, leads to a transient
physiological endometritis due to complex interactions
between the cellular and lymphatic immune response (the neutrophils,
immunoglobulins, the complement system) and to
mechanical clearance (myometrial contractions). There is as yet
no consensus about the significance of this inflammatory process
for fertilization.
The present project used endometrial biopsies from mares in
estrus to study the effects of intrauterine application of isolated
inseminate components (sperm, seminal plasma and extender)
on the occurrence of neutrophils and other inflammatory cells:
macrophages, lymphocytes, plasma cells, eosinophils and mast
cells. The results showed that the different involvement of individual
components of the inseminate to different degrees and at different
times influenced the cell density of neutrophils, IGA-producing
plasma cells, and macrophages. These phenomena are
discussed in terms of their etiopathogenesis and their relevance
for fertility.
Entzündung des Endometriums nach
Bedeckung/Besamung („post-breeding induced
Endometritis“, PBIE)
Als Endometritis werden alle entzündlichen Prozesse des Endometriums
bezeichnet, die qualitativ sowie quantitativ über die physiologische
zyklische Selbstreinigung hinausgehen, unabhängig von
ihrer Ätiologie. Es handelt sich um Infiltrationen freier Zellen in der
Uterusschleimhaut, die durch den vorkommenden Zelltyp, die Lokalisation,
die Verteilung der Infiltrate sowie den Grad der Infiltration
charakterisiert werden. Die Beurteilung des Schweregrades der
Entzündung erfolgt unter Berücksichtigung der Ausdehnung und
Verteilung der zellulären Infiltrate innerhalb des Endometriums.
Jede Bedeckung/Besamung löst bei der Stute eine akute entzündliche
Reaktion des Endometriums aus. Eine ähnliche Entzündung
kann bei Ratten, Mäusen und Kaninchen sowie bei Frauen in der
Schleimhaut der Vagina beobachtet werden.
Diese Endometritis (post-breeding induced Endometritis, PBIE) ist
physiologischerweise transient. Durch komplexe Interaktionen zwischen
zellulärer und humoraler Immunantwort (neutrophile Granulozyten,
Immunglobuline, Komplement) und mechanischer Clearance
(myometriale Kontraktionen) ist der Entzündungsprozess innerhalb
von 48 bis 72 Stunden abgeschlossen. Bei der persistierenden
Endometritis handelt es sich um einen entzündlichen Vorgang des
Endometriums, der länger als 96 Stunden nach der Bedeckung

Niedersächsisches Landgestüt Celle
Institut für Veterinär-Pathologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig
Klinik für Pferde der TiHo
Abb. 1: Rasterelektronenmikroskopische Darstellung der Emigration neutrophiler
Granulozyten aus dem Uterusepithel in das Uteruslumen
andauert. Pathomechanismen, die zur Persistenz der Endometritis
führen, sind in zahlreichen Studien untersucht worden (s. Abb 2).
Überwiegend wird eine Inkompetenz des uterusassoziierten
Immunssystems nicht als kausaler Faktor angesehen.
Als wesentlicher klinischer Indikator für das Vorliegen einer persistierenden
Endometritis gilt die ultrasonographische Darstellung
Abb. 2: Übersicht über die in der Literatur diskutierte Ätiopathogenese endometrialer Reaktionen nach
Bedeckung/Besamung bei genitalgesunden („resistant“) und endometritisanfälligen („susceptible“)
Stuten.
einer Flüssigkeitsakkumulation mit einem Durchmesser von ≥2cm
12-36 Stunden post inseminationem. Intrauterine Flüssigkeitsansammlungen
können mit Fertilitätsstörungen verbunden sein, da
der Pferdeembryo ~6 Tage post ovulationem vom Eileiter in ein entzündliches
und damit nicht-rezeptives Uterusmilieu gelangt. Die fertilitätsmindernde
Relevanz intrauteriner Flüssigkeitsansammlungen
infolge Bedeckung oder Besamung wird in der Literatur kontrovers
diskutiert. Als wesentliche Ursache für eine gestörte Fertilität gilt bei
der Stute eine herabgesetzte Motilität des Uterus. Dies kann dazu
führen, dass einerseits der Spermientransport in Richtung Eileiter
gestört ist, andererseits die „uterine clearance“, d.h. die Entfernung
überschüssiger Flüssigkeit und Zellmaterials aus dem Uterus nach
einer Insemination herabgesetzt ist.
Einfluss von Inseminatkomponenten (Spermien,
Seminalplasma, Verdünner)
Eine Vielzahl von Forschungseinrichtungen beschäftigt sich mit der
PBIE der Stute; entscheidend für eine differenzierte Beurteilung der
teils widersprüchlichen Ergebnisse dieser Studien dürfte die
Berücksichtigung der Untersuchungsparameter, der zeitlichen
Abstände bei Verlaufsuntersuchungen sowie deren Anzahl und der
Reproduktionsstatus der Versuchsstuten sein. Der überwiegende
Anteil dieser Publikationen zur „uterinen clearance“ der Stute
befasst sich mit Untersuchungen zur Uterusmotorik sowie der
Erfassung der Anzahl aus Rückspülungen
gewonnener, intraluminaler polymorphkerniger
neutrophiler Granulozyten (PMN), einschließlich
deren Funktionseigenschaften in-vitro.
Zum Einfluss der Bedeckung/Besamung auf das
Auftreten von PMN und weiterer Entzündungszellen,
wie Makrophagen, Lymphozyten, Plasmazellen,
eosinophilen Granulozyten und Mastzellen,
im gesamten Endometrium der Stute ist nur
wenig bekannt; dieser Aspekt wurde im Projekt
der eigenen Arbeitsgruppe unter Berücksichtigung
der Effekte isolierter Inseminatkomponenten
(Spermien, Seminalplasma, Verdünner)
untersucht.
Am 17. Zyklustag wurde klinisch-genitalgesunden,
östrischen Stuten einmalig intrauterin Aliquote
von konstant 20 ml einer sterilen NaCl-
Lösung (Kontrolle), Verdünner, Seminalplasma,
seminalplasmafreie Spermiensuspension sowie
ein Inseminat (verdünnte Spermaportion) appliziert.
Endometriumbiopsieproben wurden zu den
Zeitpunkten vor (0h), sowie 6-8h und 48 h nach
intrauteriner Applikation gewonnen. Die Effekte
der Inseminatkomponenten auf das Endometrium
wurden durch histopathologische (Hämatoxylin-Eosin-Färbung),
enzymhistochemische
(Naphthol-AS-D-Chlorazetat-Esterase ClAE-Darstellung
von PMN, 1-Naphthylazetat-Esterase
(ANAE)-Darstellung von Makrophagen) und
immunhistochemische (CD3-Rezeptoren der
T-Lymphozyten, Darstellung IgG,A,M produzie-
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Niedersächsisches Landgestüt Celle
Institut für Veterinär-Pathologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig
Klinik für Pferde der TiHo
Abb. 3: Unterschiede in der PMN-Dichte im Stratum compactum vor (0h), 6-8h
und 48h nach intrauteriner Flüssigkeitsapplikation bei östrischen Warmblutstuten
unter Berücksichtigung des endometrialen Ausgangszustandes (o.b.B.,
Endometritis, Endometritis und Endometrose, Endometrose) (Mittelwertdarstellung,
±SD)
render Plasmazellen) Untersuchungsverfahren ermöglicht. Mikroskopisch
wurden je nach Zelltyp 5-15 Gesichtsfelder im Stratum
compactum inkl. luminalem Epithel sowie im Stratum spongiosum
auf das Vorkommen von Entzündungszellen untersucht.
Nach Auswertung der prae applicationem gewonnenen Bioptate
(0 h) wurden die Stuten zunächst, unabhängig von ihrer Gruppenzuordnung,
in vier verschiedene histopathologische „Klassen“ eingeteilt:
Stuten mit ungeschädigtem Endometrium, mit Endometritissymptomen,
mit Endometrose oder mit entzündlichen und fibrotischen
Läsionen der Uterusschleimhaut. Dadurch wurde zusätzlich
die Beeinflussung des initialen histopathologischen Endometriumzustandes
auf den Reaktionsverlauf untersucht. Aus der Klassenverteilung
konnte keine signifikante Veränderung des Reaktionsvorganges
hinsichtlich der Infiltration mit PMN, Lymphozyten, Makrophagen
sowie Mastzellen bei Stuten mit geschädigtem Endometrium
im Vergleich zu gesunden Probanden festgestellt werden (s.
Abb. 3). Durch eine vorab bestehende Endometritis war jedoch die
Rekrutierung von IgA-Plasmazellen beeinträchtigt.
Die entzündliche Reaktion der Uterusschleimhaut nach der Bedeckung/Besamung
entspricht, wie in Abbildung 4 dargestellt, im
pathohistologischen Kontext einer akuten katarrhalischen Endometritis,
welche im Wesentlichen durch Infiltrate von PMN im Stratum
compactum und im luminalen Epithel charakterisiert werden kann.
Die intrauterine Applikation von Spermien, verdünntem Samen
(Inseminat) sowie Seminalplasma verursachte einen signifikant größeren
Anstieg der Infiltration mit PMN als die Applikation von Verdünner
bzw. von Kochsalzlösung (Kontrolle). Diese Unterschiede
werden zum einen als Effekte einer Wirkung von Spermatozoen
und gewissen Faktoren des Seminalplasmas auf Chemotaxis, Vermittlung
von Komplementfaktoren und Entzündungsmediatoren der
PMN und zum anderen als Folge mechanischer Reize nach Applikation
eines bestimmten Flüssigkeitsvolumens (Verdünner, Kochsalzlösung)
auf die Schleimhaut interpretiert. Die Clearance erwies
sich innerhalb von 48 Stunden als vergleichsweise verzögert bei
Stuten der Seminalplasma- und Verdünnergruppe.
0h
6-8h
48h
Nach Applikation von Spermien, Inseminat sowie Kochsalzlösung
(Kontrolle) waren über den Untersuchungszeitraum IgA-produzierende
Plasmazellen signifikant vermehrt nachweisbar; im Gegensatz
dazu bestimmten Makrophagen nach intrauteriner Applikation
von Seminalplasma bzw. Verdünner das histologische Bild. Die
Applikation von Verdünner führte möglicherweise auch zu einer
intensivierten Degranulation von Mastzellen.
Zusammenfassend sind bei der PBIE die Einzelkomponenten des
Inseminates (Spermien, Seminalplasma, Verdünner), bezogen auf
die Zelldichte der PMN, graduell und temporär unterschiedlich
beteiligt. Die Rekrutierung von Lymphozyten, Plasmazellen, Makrophagen
und Mastzellen könnte dahingehend gedeutet werden,
dass möglicherweise auch bei der Stute die Konfrontation des
Endometriums mit dem semiallogenetischem Material Hengstsperma
nicht nur hinsichtlich uteriner Reparationsprozesse, sondern
auch im Sinne einer immunomodulatorischen Auseinandersetzung
im Verbund mit möglicherweise fertiltätsfördernden Effekten spezifischer
Inseminatkomponenten (Seminalplasma) – wie bei Maus,
Schwein und Mensch beschrieben – von Bedeutung sein könnte.
Dies wird das Ziel weiterer Untersuchungen sein.
Aus den bisher vorliegenden Erkenntnissen zur PBIE ergeben sich
Notwendigkeiten zielgerichteter, weiterer Untersuchungen aber
auch Hinweise für Anwendungsmöglichkeiten in der Praxis der Pferdezucht
zur Verbesserung der Fertilitätsresultate der Stute; so
befassen sich bereits publizierte und aktuelle Studien mit Verbesserungen
des Besamungsmanagements und der Besamungstechnik
via Beeinflussung des Myometriums und der uterinen Immunantwort
durch spezifische Modifikationen der Inseminatbeschaffenheit.
0h
6-8h
48h
Abb. 4: Befunde von Endometriumbiopsien vor (0h), 6-8h und 48h nach intrauteriner
Applikation eines verdünnten Inseminats einer östrischen Warmblutstute
(Naphthol-AS-D-Chlorazetat-Esterase (ClAE)-Darstellung polymorphkerniger
neutrophiler Granulozyten PMN)
0h gesundes Endometrium
6-8h diffuse, mittelgradige Infiltration des Stratum compactum mit PMN;
einige PMN auch im Stratum spongiosum
48h einzelne PMN-Infiltrate im Stratum compactum noch vorhanden

Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Mariensee (FAL)
Arbeitsgruppe Immunologie der TiHo
Zentrum für Frauenheilkunde und Zentrum für Anatomie der Georg-August-Universität Göttingen
Hans-Joachim Schuberth, Holm Zerbe, Hans-Wilhelm Michelmann, Peter Schwartz, Ulrike Taylor, Henning Wendt,
Antje Frenzel und Detlef Rath
Qualitätsmanagement im Uterus: nur ausgewählte
Spermien erreichen die Eizelle
Zusammenfassung
Für eine erfolgreiche Konzeption muss eine ausreichende Anzahl
befruchtungsfähiger Spermien im Eileiter auf die zu befruchtende
Eizelle treffen. Nach einer Bedeckung oder Besamung kommt es
bei vielen Spezies zu einem regulierten Einstrom neutrophiler
Granulozyten in den Uterus. Ziel der gegenwärtigen Forschung
ist es, die Regulation des Einstroms näher zu analysieren und die
Mechanismen zu klären, über die Granulozyten an der Selektion
befruchtungskompetenter Spermatozoen teilnehmen. Diese
frühe Phase nach der Besamung ist zudem Teilaspekt einer komplexen
immunologischen Gesamtreaktion im Uterus, welche nicht
nur ausgewählte Spermien die Eizelle erreichen lässt, sondern
auch die Vorraussetzung für eine erfolgreiche Trächtigkeit schafft.
Warum so viele Spermien?
Bei einer Besamung gelangen natürlicherweise viele Milliarden
Spermien in die Vagina, die Cervix
oder in den Uterus. Die Anzahl der
Spermien und die Lokalisation der
Deposition variiert je nach Spezies.
Der scheinbare Überfluss äußert
sich auch darin, dass beim Schwein
in den ersten Stunden nach Besamung
durch Rückfluss aus dem
weiblichen Genitale etwa 25% der
applizierten Spermatozoen schlicht
verloren gehen. Warum werden so
viele Spermien bei der Besamung
gebraucht, wo doch nur wenige für
die Befruchtung einer oder mehrerer
Oozyten benötigt werden? Die
Beantwortung dieser Frage wird
umso wichtiger, als bei landwirtschaftlichen
Nutztieren die Besamung
schon seit einigen Jahrzehnten
routinemäßig angewendet wird
und neuere biotechnologische Verfahren den Einsatz immer geringerer
Spermatozoenmengen implizieren. Beispielsweise enthalten
Besamungsportionen mit verfahrenstechnisch gesextem Sperma
nur noch 10% (Rind), 2,5% (Schwein) oder 4-10% (Pferd) der üblichen
Spermatozoendosierungen. Eine nahe liegende Antwort lautet,
dass Vielzahl gleichzeitig auch Auswahl ermöglicht. Eine weitere
Antwort ergibt sich, wenn man das physiologische Folgegeschehen
im Uterus betrachtet. Die Interaktionen, die viele Spermatozoen
mit Zellen im Uterus eingehen, und die Wechselwirkungen zwischen
Bestandteilen des sie umgebenden Seminalplasmas mit Zel-
Summary
A successful conception requires sufficient numbers of spermatozoa
to reach the oocyte in the oviduct. Insemination with an abundance
of spermatozoa is followed in many species by a regulated
influx of granulocytes into the uterus. Ongoing research focuses
on the analysis of this influx, its regulation and the mechanisms
of granulocyte-mediated selection of competent and fertilizing
spermatozoa. The early phase after insemination is part of a
complex immunological reaction in the uterus, which not only
results in sperm selection but also creates the environment necessary
for a successful pregnancy.
len des Uterus induzieren Mechanismen und Folgeprozesse, die
sich positiv auf eine erfolgreiche Trächtigkeit oder Schwangerschaft
auswirken. Somit tragen die physiologischen Mechanismen im Uterus
nach Besamung zur optimalen Auswahl von Spermien bei und
schaffen die Voraussetzungen für erfolgreiche Trächtigkeit (Abb. 1).
Abb. 1: Eine Besamung kurz vor (prä) oder nach (post) dem Eisprung führt zum Granulozyten-Einstrom. Etwa zu
diesem Zeitraum findet eine Spermienselektion statt. Das Milieu im Gewebe bleibt bis zur Nidation entzündlich (proinflammatorisch).
Im Verlauf der Trächtigkeit kehrt sich die Situation um; das graviditätserhaltende Milieu ist antiinflammatorisch.
Vielzahl ermöglicht Auswahl
Neben einer potenziellen Auswahl der besten Spermatozoen (ein
noch nicht definierbarer Begriff) wird durch das Prinzip der Selektion
sichergestellt, dass nicht befruchtungsfähige oder geschädigte
Spermien mit befruchtungsfähigen Spermien konkurrieren.
Selektionsvorgänge an Spermien während ihrer Wanderung durch
den Uterus sind allerdings nur teilweise bekannt und werden gegen-
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Arbeitsgruppe Immunologie der TiHo
Zentrum für Frauenheilkunde und Zentrum für Anatomie der Georg-August-Universität Göttingen
wärtig genauer untersucht. Zwei denkbare Szenarien werden
geprüft. Die These der Negativ-Selektion geht davon aus, dass
überflüssige Spermien aktiv entsorgt werden, und damit im Wesentlichen
befruchtungsfähige Spermien übrig bleiben. Der anderen
These liegt die Idee der Positiv-Selektion zu Grunde, die besagt,
dass Spermien, die mit Zellen im Uterus in Kontakt treten, zu
befruchtungsfähigen Spermien werden. Mit hoher Wahrscheinlichkeit
greifen beide Selektionsprinzipien ineinander und komplementieren
sich.
Wer wählt wen aus?
Spermatozoen können im Uterus prinzipiell mit allen Zellen interagieren,
die dort residieren. Dies sind zunächst uterine Epithelzellen.
Vergleichbare Interaktionen wurden mit Epithelzellen des Eileiters
beschrieben. Ihnen wurde eine reifende Wirkung auf die später
befruchtenden Spermien zugeschrieben. Über Bindungen von Spermien
an Uterus-Epithelzellen ist bisher wenig bekannt. Spermatozoen
gehen während der Uteruspassage ebenfalls Interaktionen mit
uterinen Leukozyten ein. Die Analyse der vorhandenen Leukozyten
im Uterus des Schweins und des Rindes vor einer Besamung ergab
ein heterogenes Bild. Beim Rind lassen sich kaum Leukozyten aus
einem nicht besamten Uterus ausspülen. Dennoch zeigen rasterelektronenmikroskopische
Aufnahmen viele neutrophile Granulozyten
in engem Kontakt mit der Oberfläche des Uterusepithels
(Abb. 2A), so dass sie durchaus an der postulierten Spermienselektion
aktiv teilhaben könnten. Das Rind belässt es offensichtlich bei
diesem Status. Nach umfangreichen Studien, in denen unterschiedliche
Besamungsverfahren mit verschiedenen Spermapräparationen
geprüft wurden, zeigte sich zu keinem der gewählten Zeitpunkte
nach Besamung ein weiterer Einstrom neutrophiler Granulozyten.
Beim Schwein lassen sich vor der Ovulation (prä-ovulatorisch) nur
relativ wenige Leukozyten im Uteruslumen nachweisen (etwa 1 Million
pro Uterus). Diese Zahl wächst post-ovulatorisch auf das 50 bis
180-fache an. Diese Immunzellen setzen sich beim Schwein im
Wesentlichen aus neutrophilen Granulozyten und Monozyten
zusammen (Abb. 2B). Die Besamung beim Schwein belässt es
jedoch nicht bei diesem Status quo, bei dem das Verhältnis Spermien
zu Leukozyten anfangs immer zu Gunsten der Spermien ausfällt.
Vielmehr kommt es, mit einer zeitlichen Verzögerung von ca.
90 Minuten bis 3 Stunden, zu einem deutlichen Leukozyteneinstrom,
diesmal hauptsächlich von neutrophilen Granulozyten.
Abb. 2: A) Granulozyten auf dem Endometrium des Rindes. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme, 2000x Vergrößerung. Die Pfeile kennzeichnen einige der
erkennbaren Granulozyten. B) Zellen im Uterus von Schweinen vor einer Besamung (durchflusszytometrische Messung). Neutrophile Granulozyten (nG), Monozyten
(Mz) und Epithelzellen (Ez) lassen sich anhand ihrer relativen Zellgröße und Komplexität voneinander differenzieren.

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Arbeitsgruppe Immunologie der TiHo
Zentrum für Frauenheilkunde und Zentrum für Anatomie der Georg-August-Universität Göttingen
Signal zum Einstrom von
neutrophilen Granulozyten
Im Tiermodell konnten wir zeigen,
dass viele Faktoren diesen
Einstrom steuern können, allerdings
quantitativ sehr unterschiedlich.
Hierzu zählt ein einfacher
Volumenreiz (physiologische
Salzlösung), chemotaktische
(chemisch anlockende)
Faktoren wie das Chemokin
Interleukin-8, der Komplementfaktor
C5a, das Seminalplasma,
die Spermien, und das bei der
Besamung verwendete Verdünnungsmedium
für porcine Spermien.
Die Granulozyten treten
dabei in der vergleichsweise langen
Gebärmutter der Sau auf
breiter Front in das Lumen ein.
Gerade der Blick auf die Effekte
des Seminalplasmas im Vergleich
zum Verdünnermedium
lässt erkennen, dass ein Einstrom
neutrophiler Granulozyten
nicht um jeden Preis erwünscht
ist. Vielmehr scheint die Kombi-
nation aus Seminalplasma und Spermien die neutrophilen Granulozyten
moderat anzulocken (Abb. 3).
Es wird davon ausgegangen, dass Interleukin-8 eine bedeutende
Rolle bei der Granulozyten-Rekrutierung in den Uterus spielt, und
dass es von den endometrialen Epithelzellen auch selbst gebildet
wird. Bei der Frau stimuliert das Seminalplasma die Freisetzung
dieses Chemokins aus den Makrophagen und den Zervikalschleimhautzellen.
Beim Schwein führen Inhaltstoffe des Seminalplasmas
(Spermadhäsine) dazu, dass von Makrophagen eine für Granulozyten
chemoattraktive Substanz frei gesetzt wird. Wir fanden ebenso
Hinweise, dass die vor der Bedeckung im Uteruslumen vorliegenden
Monozyten an der Induktion des Granulozyteneinstroms in den
Uterus beteiligt sind. Auch Spermien selbst können, nach Kontakt
mit Epithelzellen, zur Induktion chemoattraktiver Moleküle beitragen.
Diese insgesamt fördernden, stimulierenden Wirkungen von
Ejakulatbestandteilen werden teilweise wieder aufgefangen und
durch hemmende Eigenschaften moduliert. So erwies sich porcines
Seminalplasma in vitro als inhibierend für eine Interleukin-8-induzierte
Chemotaxis von Granulozyten.
Neutrophile Granulozyten – Fresszellen und Selektierer
Diesen Fress-Zellen, sie sind in der Lage zu phagozytieren, schrieb
man bisher nahezu ausschließlich eine reinigende Funktion zu; sie
sollten im Sinne der Negativ-Selektion überflüssige, nicht-motile,
geschädigte, zu früh und damit falsch gereifte Spermien entsorgen.
Überdies eliminieren sie eingedrungene Mikroorganismen und stellen
binnen kurzer Zeit ein steriles Milieu wieder her. Ob die Phagozytose
der Spermatozoen durch uterine, polymorphkernige neutro-
Abb. 3: Die Zahl einwandernder Granulozyten in den Uterus des Schweines hängt vom Zeitpunkt der Besamung relativ
zum Eisprung ab (prä- oder post-ovulatorisch) und ist größer, wenn statt Seminalplasma ein Spermienverdünnermedium
eingesetzt wird.
phile Granulozyten (PMN) selektiv erfolgt oder ein randomisierter
Prozess ist, kann noch nicht beantwortet werden. Zumindest deuten
Beobachtungen darauf hin, dass neben erkennbar geschädigten
Spermien auch solche gebunden werden, die augenscheinlich
vital und morphologisch intakt sind. Die Phagozytose von Spermatozoen
(Abb. 4) scheint jedoch unter In-vitro-Bedingungen nicht
schnell abzulaufen. Das wesentliche Element der Interaktion zwischen
PMN und Spermien ist eine nicht sehr stabile, transiente Bindung
und Kontaktaufnahme.
Abb. 4: Phagozytose eines Spermiums im Uterus des Schweins.
Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme. 3000x Vergrößerung.
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Generell setzt die Positiv- wie die Negativselektion voraus, dass
sich Spermien-Subpopulationen in molekularen Strukturen unterscheiden,
die von anderen Zellen mittels Rezeptoren erkannt werden
können. Diese molekulare Basis der Unterscheidung könnte
auf der Expression von Lektinen oder deren Zielstrukturen (Zuckermotiven)
liegen. Lektine sind Zucker-bindende Proteine, die im Zentrum
eines komplexen Zuckermoleküls einen bestimmten Zucker
erwarten, um binden zu können. Zellen des Immunsystems erkennen
und beeinflussen sich gegenseitig über verschiedene Zucker-
Lektin-Bindungen. Solche Interaktionen spielen ebenfalls eine Rolle
bei der Bindung von Spermien an Epithelzellen des Eileiters und bei
der Bindung von Spermien an die zu befruchtenden Eier. Analysen
von Spermien und Granulozyten haben gezeigt, dass sie eine Vielzahl
unterschiedlicher Zuckermotive an der Oberfläche aufweisen.
Mit Hilfe fluoreszenzmarkierter Lektine können Veränderungen an
Spermien identifiziert werden (Abb. 5).
Die Oberflächenstrukturen von Granulozyten unterscheiden sich
nach ihrer Wanderung durch das Gewebe in das Uteruslumen beim
Rind und beim Schwein signifikant von denen aus dem Blut. Dies
betrifft bestimmte Adhäsionsmoleküle, Komplementrezeptoren,
Lektine wie auch einige von Lektinen erkannte Zuckermotive.
Gegenwärtig untersuchen wir, ob diese modulierten Zelloberflächenstrukturen
für die selektive Erkennung einzelner Spermienpopulationen
relevant sind, und welche Folgen dies für die gebundenen
Spermien sowie für die Zellen selbst hat.
Eine erhebliche Bedeutung kommt hier der vermittelnden Rolle von
Inhaltsstoffen des Seminalplasmas zu. Es gilt unter anderem, den
Widerspruch zwischen der vielfach publizierten massiven Phagozytose
von Spermien durch Granulozyten und dem hemmenden Einfluss
von Seminalplasma auf diese Zellfunktion zu klären. Hypothetisch
lässt sich die These formulieren, dass Komponenten des
Seminalplasmas anfangs dafür Sorge tragen, die Interaktionen zwischen
Granulozyten und Spermien nur transient zu gestalten. Dies
würde Zeit für eine subtilere Selektion von Spermien lassen und
andererseits die Zellen an einer zu frühen und zu massiven Produktion
reaktiver Sauerstoffprodukte (ROS, reactive oxygen species)
hindern. In vitro führten ROS-produzierende Granulozyten zu einer
gesteigerten Spermatozoenkapazitation, die durch die Zugabe von
Seminalplasma umgekehrt werden konnte. Reaktive Sauerstoffspezies,
zu früh und massiv gebildet, können die Motilität von Spermien
deutlich reduzieren, als auch für das Endometrium schädigende
Folgen haben.
Haben die regulierten Interaktionen zwischen Granulozyten und
Spermien zur Selektion der besten Spermien geführt, steht einer
effektiven Phagozytose der überzähligen Spermien nichts mehr im
Wege.
Ausblick
Die Gesamtreaktionen im Uterus nach Besamung bis zur Nidation
eines befruchteten Eies werden durch Spermien, Komponenten des
Seminalplasmas, Immunzellen und die Interaktionen dieser Komponenten
mit Endometriumszellen bestimmt. Die einzelnen Mechanismen
führen nicht nur zur Selektion von befruchtungsfähigen Spermien,
sondern schaffen ebenso ein Milieu, das durch das Vorherrschen
entzündlicher Mediatoren im Gewebe gekennzeichnet ist.
Dieses so genannte pro-inflammatorische Milieu scheint für die
Kontaktaufnahme zwischen befruchtetem Ei und der Uterusschleimhaut
essentiell zu sein und die Embryonenentwicklung zu
fördern. Überdies werden immunologische Folgeprozesse eingeleitet,
die sicherstellen, dass die sich entwickelnden Embryonen nicht
vom mütterlichen Immunsystem abgestoßen werden. In der
Summe sind dies äußerst komplexe, ineinander greifende Abläufe,
deren tiefere Kenntnis mittelfristig Schlussfolgerungen für biotechnologische
Ansätze zur Verbesserung der Befruchtungserfolge in
der Tierproduktion ermöglicht.
Abb. 5: Fluorochrom-markierte, zuckerbindende Lektine markieren in unterschiedlicher Weise membranintakte und membrangeschädigte porcine Spermien. Mit
Erdnussagglutinin (FITC-PNA) können 5 Spermien-Subpopulationen im Durchflusszytometer unterschieden werden (Kreise).

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Niedersächsisches Landgestüt Celle
Veterinärfakultät der Universität Sydney
Detlef Rath, Harald Sieme, Heide Buss, Chis Maxwell
Hallo Herr Doktor, bitte ein Stutfohlen!
Zusammenfassung
In den vergangenen Jahren ist ein Sortiersystem für Spermien
entwickelt worden, das auf der Flowzytometrietechnik basiert. Da
sich die Geschlechtschromosomen geringfügig in ihrer Größe
unterscheiden, kann nach Fluoreszenzfärbung eine Selektion in
X- und Y-Chromosom tragende Spermien vorgenommen werden.
Auch im modifizierten Hochgeschwindigkeitsflowzytometer bleibt
die Zahl der „gesexten“ Spermien auf ca. 15 Millionen pro Stunde
beschränkt, aber die Reinheit der Proben liegt deutlich über 90%.
Weltweit sind bereits mehr als 40 000 Nachkommen nach diesem
Verfahren geboren worden. Es gibt aber deutliche Unterschiede
zwischen den Tierarten, wobei für Bullensperma der kommerzielle
Einsatz in sehr begrenztem Umfang bereits erfolgt.
Zurzeit werden in Mariensee in mehreren Kooperationsprojekten
vor allem Hengst- und Ebersperma sortiert und die Konservierungsverfahren
optimiert.
Hallo Herr Doktor, bitte ein Stutfohlen! So oder ähnlich wird wohl in
Zukunft häufig an den Tierarzt die Bitte herangetragen werden,
„gesextes Sperma“ bei der Besamung einzusetzen. Damit wird ein
in der Tierzucht seit langem gehegter Wunsch Wirklichkeit, das
Nachkommengeschlecht vor der Besamung bereits festzulegen.
Seit mehreren Jahren wird an einer Technik gearbeitet, die jetzt kurz
davor steht, bei den Nutztierspezies in die Routinebesamung übernommen
zu werden. Am weitesten ist die Sortiertechnik beim Rind
vorangeschritten, was vor allem im Zusammenhang mit der relativ
geringen Anzahl an Spermien, die für eine erfolgreiche Besamung
notwendig ist, steht.
Biologischer Hintergrund
Bei Säugetieren wird das Geschlecht primär durch die Geschlechtschromosomen
in den Samenzellen bestimmt. Eine Gensequenz
(SRY) auf dem kurzen Arm des Y-Chromosoms ist für die Anlage
des Hodengewebes verantwortlich, nachdem die Urgeschlechtszellen
in die Genitalfalte des frühen Fetus eingewandert sind.
Das Y-Chromosom ist etwas kleiner als das X-Chromosom und enthält
entsprechend weniger DNA. Der relative, speziesspezifische
Unterschied beträgt bei den Nutztierspermien 3,5 - 4%. Dieses ist
der einzige, nachgewiesene Unterschied zwischen X- und Y-Chromosom
tragenden Spermien, der für eine Separation aus dem Ejakulat
zuverlässig genutzt werden kann. Alle anderen, theoretisch
möglichen, physikalischen und immunologischen Unterschiede
konnten nicht verifiziert werden oder ließen sich technisch bisher
nicht nutzen.
Abstract
Recently, a new method for sorting of spermatozoa has been
developed on the basis of flow cytometry. Differences in the size
of sex chromosomes are visualized by fluorochromes and sorted
into sperm populations bearing X and Y chromosomes. Although
the output is limited to 15 million spermatozoa per hour even with
a modified high speed flow cytometer, the purity of samples is
greater than 90%. Worldwide more than 40,000 offspring have
thus far been produced with this technique, but there are obvious
species-related differences. Sex-sorted bull semen is now almost
ready for commercial production. At present, our research is concentrated
on spermatozoa from stallions and boars. Several
cooperative projects focus on the optimization of long-term
preservation of sperm.
Technische Lösungen
Zur Darstellung der Unterschiede der Geschlechtschromosomen
werden die Spermien mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Hoechst
33342), der sich an die Chromosomen anlegt, gefärbt. In einem an
die Samenzellmorphologie angepassten Flowzytometer mit angekoppelter
Sortiervorrichtung werden die Spermien individuell erfasst
und entsprechend ihres Fluoreszenzsignals nach UV-Laser Exposition
zwei Populationen zugeordnet. Um eine hohe Reinheit zu
gewährleisten, werden nur die Spermien ausgewählt, die mit ihrer
flachen Seite senkrecht zum Laserstrahl stehen. Der Sortiervorgang
erfolgt nach Fluoreszenzsignal abhängiger elektrischer Aufladung
der Spermatröpfchen im elektrostatischen Feld. In speziellen
Auffangmedien werden pro Stunde bis zu 15 Millionen gesexte
Spermien gesammelt. Die Sortierreinheit beträgt dabei deutlich
über 90%. Nach kurzer Zentrifugation stehen die gesexten Spermien
zur Besamung zur Verfügung oder können für den späteren
Gebrauch tiefgefroren werden. Allerdings bestehen noch erhebliche
Unterschiede zwischen den verschieden Nutztierspezies bei der
Anwendung von gesextem Tiefgefriersperma.
Einsatz in der Tierzucht
Ursprünglich war es das Ziel der amerikanischen Forschergruppe
um Professor L.A. Johnson in Washington gewesen, kleinere, sehr
reine Spermienpopulationen zu sortieren und diese auf andere
geeignete Parameter zu untersuchen, die einen großflächigen Einsatz
in der Tierzucht erlauben sollten. Mittlerweile ist die flowzytometrische
Technik trotz einiger noch nicht vollkommen gelöster Probleme
zu einem stabilen und zuverlässigen Verfahren weiterentwickelt
worden, so dass es Sinn macht, über Anwendungsbereiche in
der Tierzucht nachzudenken. Sortiertes Bullensperma wird in den
USA und England bereits für den kommerziellen Einsatz in
beschränktem Umfang angeboten.
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Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Mariensee (FAL)
Niedersächsisches Landgestüt Celle
Veterinärfakultät der Universität Sydney
Beim Rind kann gesextes Sperma beispielweise in Milchbetrieben
zur Erstellung von Kuhkälbern benutzt werden, da HF-Bullenkälber
zur Mast kaum zu verwenden sind. Testbesamungen zur Ermittlung
des Zuchtwertes der Bullen können bis um 50% reduziert werden,
ohne die statistische Präzision der Zuchtwertschätzung zu verringern.
Färsen können mit X-chromosomalen Spermien besamt werden,
um die Rate der Todgeburten zu reduzieren. Außerdem könnten
gezielt Bullenmütter erzeugt werden. Bei Mastrassen wird eher
Wert auf männliche Nachkommen gelegt. Gesexte Y-chromosomale
Spermienpopulationen sind in ihrer Reinheit zwar geringfügig
schlechter als X-chromosomale (2%-5%), aber prinzipiell besteht
für den Sortiervorgang kein Unterschied.
In der Endstufe der Schweineproduktion steht die Erzeugung weiblicher
Nachkommen im Vordergrund des Interesses. Seit kurzem
wird in einigen EU-Staaten über die Abschaffung der Ferkelkastration
nachgedacht; beispielsweise wird Norwegen die Kastration ab
2009 nicht mehr zulassen. Gesextes Sperma könnte theoretisch
eine Alternative sein, wenn es gelingt, die Effizienz des Sortierprozesses
deutlich zu steigern. Beim gegenwärtigen technischen
Stand kommt lediglich ein Einsatz in ausgewählten Zuchtbereichen,
z.B. Nukleusherden in Frage, denn trotz neuer Besamungsverfahren
werden immer noch 20-mal mehr Spermien für die Besamung
benötigt als beim Rind.
Seit der Einführung der hysteroskopischen Besamung konnte die
für die Besamung bei Stuten benötigte Spermienzahl deutlich reduziert
werden. Der Sortierprozess ist aufgrund der Spermienkopfform
und des höheren DNA-Unterschiedes
zwischen den Spermienpopulationen
effektiver als bei anderen Tierarten.
So wird in absehbarer Zeit der
Wunsch nach Besamung mit gesextem
Sperma auch beim Pferd zur
Routine gehören können. Auch bei
Schafen war die hysteroskopische
Besamung mit gesextem Tiefgefriersperma
sehr erfolgreich.
Eine besondere Bedeutung hat
gesextes Sperma bei der Erhaltung
von Rassen in Genreserveprogrammen
sowie zur Erhaltung bedrohter
Tierarten. Hierbei wird Wert auf „Xchromosomale
Spermien“ gelegt,
denn mit weiblichen Nachkommen
kann eine Stabilisierung bedrohter
Arten und Rassen deutlich schneller
erzielt werden. So werden außer den
Spermien unserer Nutztiere auch die
von Primaten, Delfinen, Elefanten,
Nashörnern, Büffeln und andere exotischer
Tierarten für Versuche genutzt,
um entsprechende Spermabanken
anlegen zu können. Für die letzten
drei genannten Spezies werden diese
Untersuchungen u.a. in Mariensee
gemeinsam mit nationalen und internationalen
Forschungsinstitutionen
durchgeführt.
Aktuelle Forschungsarbeiten
Abb. 1: Nachkommen aus gesextem Sperma in Mariensee.
Die Ferkel wurden im In-vitro-System via ICSI erstellt, das Kalb
stammt aus einer Besamung in den Uteruskörper.
Seit dem Jahr 2000 steht dem Institut für Tierzucht der FAL in Mariensee
das einzige Flowzytometer in Deutschland zur Verfügung,
das zur Sortierung von Spermien geeignet ist. Das Gerät dient ausschließlich
Forschungszwecken, von denen im Folgenden einige
Projekte, die vorwiegend in Zusammenarbeit mit Institutionen des
Virtuellen Zentrums für Reproduktionsmedizin durchgeführt wurden,
aufgeführt sind.
Rind: Eines der Hauptprojekte der vergangenen zwei Jahre diente
der Verbesserung von gesextem Tiefgefriersperma. Zwar wird dieses
bereits kommerziell angeboten, die Qualität ist aber sehr variabel
und konnte bislang nicht überzeugen. Mittlerweile ist es uns
gelungen, einige der Hauptbelastungsquellen während des Sortiervorganges
aufzudecken und ein verbessertes Sortierverfahren mit
geändertem Processing und neuen Verdünnern (Sexcess®) zu entwickeln.
Die Besamungsergebnisse bei rund 500 Färsen verschiedener
Rassen und Nutzungstypen unterschieden sich nicht mehr
von den Kontrollbesamungen mit unsortiertem Sperma identischer
Ejakulate und lagen in der Befruchtungsrate über 70%. Auch als
gesextes Frischsperma ist es bei Lagerung im Kühlschrank für drei
Tage für die Besamung geeignet. Deutlich schlechtere Trächtigkeitsergebnisse
(~-20%) erhielten wir nach Besamung von Kühen.
Die Ursache ist zurzeit noch offen; es könnte sich aber um immunologische
Prozesse im Uterus handeln, die noch nicht verstanden
werden (s. auch Qualitätsmanagement im Uterus S. 21). Neben der
Verwendung für die Besamung wird gesextes Sperma auch zur Invitro-Befruchtung
sowie im Rahmen
des Embryotransfers mit
Erfolg eingesetzt
Schwein: Die Untersuchungen
zum Sortieren von Ebersperma
gehen auf eine langjährige Kooperation
des Instituts für Tierzucht mit
dem USDA in Beltsville zurück.
Bereits 1993 wurden gemeinsam
erste Embryonen mit gesextem
Ebersperma über In-vitro-Befruchtung
erstellt und drei Jahre später
gelang mit diesem Verfahren die
Geburt der ersten Ferkel. Interessanterweise
zeigten neuere Time-
Lapse-Studien unserer Arbeitsgruppe,
dass sich männliche und
weibliche Embryonen nach der Invitro-Befruchtung
in ihrem Entwicklungsverhalten
unwesentlich unterscheiden.
Ihr Wachstumspotential
war aber deutlich vermindert, wenn
die Eizellen vor der Befruchtung invitro
gereift werden mussten.
Noch effizienter konnten wir Ferkel
mit gewünschtem Geschlecht
erzeugen, wenn die Befruchtung
mittels intrazytoplasmatischer
Spermieninjektion (ICSI) erfolgte

Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Mariensee (FAL)
Niedersächsisches Landgestüt Celle
Veterinärfakultät der Universität Sydney
Abb. 2: High-Speed Flowzytometer zur Trennung von Spermien
(MoFlo Sx, Dakocytomation)
und je Eizelle nur eine Samenzelle zur Verfügung stehen musste.
Dieses Verfahren ist allerdings technisch aufwendig und erfordert
relativ hohe Investitionen für eine Mikromanipulationseinheit. Das
Verfahren ist aber dann sinnvollerweise einzusetzen, wenn nur
wenige oder nicht mehr funktionsfähige Spermien zur Verfügung
stehen, wie dies häufig bei bedrohten Tierarten vorkommt. Für viele
dieser Tierarten wurden noch keine Spermakonservierungsverfahren
entwickelt; hier kann über ICSI versucht werden, gereifte Eizellen
mechanisch zu befruchten.
Für den Routineeinsatz von gesextem Sperma muss die Besamung
auch beim Schwein das Mittel der Wahl sein. Üblicherweise werden
pro Besamung mindestens 1 Milliarde Samenzellen, evtl. auch
mehrmals pro Rausche, verwendet. Um die Schweinebesamung
mit gesextem Sperma zu ermöglichen,
musste daher zunächst ein
Besamungskatheter entwickelt werden,
der es erlaubt, das Sperma tief
im Uterushorn kurz vor der utero-tubalen
Verbindung zu platzieren. Damit
lassen sich Spermaverluste vermeiden.
Von mehreren Typen hat sich ein
in Spanien entwickeltes Instrumentarium
als besonders geeignet erwiesen
(Firflex®). Hiermit kann die Besamungsdosis
auf ca. 50 Millionen Spermien
reduziert werden. Erste Ferkel
aus der Besamung mit gesextem
Sperma wurden 2003 in Mariensee
geboren. Dennoch bedeutet eine
Spermadosis von 50 Millionen Spermien
eine Sortierdauer von 3 bis 5
Stunden, was zeigt, dass ein Routineeinsatz
für die Erstellung von Endprodukten
kaum rentabel sein wird. Ein
Ausweg bietet evtl. die Tiefgefrierung
von Ebersperma. Allerdings müssen
hierzu bekannte Einfrierverfahren
stark modifiziert werden. Dies wird
gegenwärtig in Mariensee in Zusammenarbeit
mit den Universitäten in
Sydney und Murcia erarbeitet.
Abb. 3: Sortierdiagramm für Hengstsperma
Pferd: Auch bei der Pferdebesamung besteht prinzipiell die Anforderung
einer relativ hohen Spermadosierung. In Kombination mit der
hysteroskopischen Besamung wurden in den USA, Argentinien,
Australien und Deutschland mehrere Fohlen aus gesextem Sperma
geboren. In Zusammenarbeit mit dem Landgestüt Celle und der
Universität Sydney wird zurzeit an einem neuen Tiefgefrierverfahren
geforscht, das in Anlehnung an die Ergebnisse aus Gefrierversuchen
mit Schweine- und Rindersperma die Belastungen beim
Sortieren und Tiefgefrieren mindern soll. Erste Ergebnisse zeigen,
dass mit dem gewählten Einfrierprotokoll Hengstspermien nach
dem Sortierprozess eingefroren werden können und dabei eine
ausreichende Bewegungsaktivität und Membranintegrität nach dem
Auftauen erhalten bleibt. Beim Vergleich eines computergesteuerten
Gefrierprozesses war kein Unterschied gegenüber einem einfachen
Verfahren im Stickstoffdampf zu erkennen. Auch zwischen
zwei Verdünnersystemen (INRA 82 und LactoseEDTA) bestand
kein nachweisbarer Unterschied. Während bei allen geprüften Verfahren
die Motilität durch die Kombination von Sortier- und Gefrierprozess
deutlich abnahm, blieben Membranintegrität und morphologische
Parameter unbeeinflusst gut. Gegenwärtig muss die Besamung
dennoch sehr genau auf den Ovulationszeitpunkt terminiert
werden, da nach dem Auftauvorgang die Überlebenszeit der
Hengstspermien auf wenige Stunden beschränkt ist.
Einen zusätzlichen Aspekt untersucht man derzeit an der Universität
Sydney. Hier wird zunächst tiefgefrorenes Sperma von Schafböcken
und Hengsten aufgetaut, im Flowzytometer sortiert, anschließend
wieder eingefroren und zum Gebrauchstermin erneut aufgetaut.
Das Sperma dieser beiden Spezies ist ausreichend widerstandsfähig,
um den Prozess zu überstehen und um zur In-vitro-
Befruchtung verwendet werden können. So könnte es bald häufiger
heißen: Herr Doktor, bitte ein Stutfohlen!
a) Jeder rote Punkt repräsentiert eine Samenzelle, Anhäufungen färben sich über gelb nach grün. Zwei deutliche
Populationen (X-und Y-chromosomale Spermien) sind zu erkennen.
b) Elektronische Aufbereitung nach Gating. Rotes und blaues Fenster dienen der Sortierentscheidung
c) Separation der Spermienpopulation nach DNA Gehalt (counts: DNA Gehalt).
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Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Mariensee (FAL)
Zentrum für Frauenheilkunde und Zentrum für Anatomie der Georg-August-Universität Göttingen
Edda Töpfer-Petersen, Detlef Rath, Hans-Wilhelm Michelmann, Dorothee von Witzendorff, Mahnaz Ekhlasi-Hundrieser,
Peter Schwartz, Erik Piehler, Silja Ebeling, Christiane Hettel, Birgit Sieg, Petra Westermann
Die Zona pellucida: Schutz- und Kommunikationsorgan
der Eizelle
Zusammenfassung
Die Zona pellucida (ZP) der Eizelle spielt für die Regulierung der
Befruchtung eine wesentliche Rolle. Voraussetzung für eine erfolgreiche
Befruchtung ist die Kohlenhydrat-vermittelte Erkennung
beider Gameten, die an dieser extrazellulären Matrix abläuft. Die
Untersuchung der beteiligten Kohlenhydrat-Rezeptorsysteme ist
daher schon lange ein Anliegen der Reproduktionsbiologie. In
einem gemeinsamen Projekt werden die Glykane der porzinen
ZP mittels moderner massenspektrometrischer Methoden (glycomics)
identifiziert, Veränderungen ihrer Struktur sowie die globalen
Veränderungen der dreidimensionalen Architektur der ZP
während der Oozytenreifung in Relation zu ihrer Funktionalität
untersucht. Die Kenntnis der Vorgänge, die bei der Reifung der
Zona pellucida ablaufen, sind von besonderem Interesse für die
Optimierung der In-vitro-Produktion von Schweineembryonen.
Die Befruchtungskaskade
Die Säugetiereizelle ist von einer hochorganisierten, dreidimensionalen
Matrix umgeben, die als Zona pellucida bezeichnet wird. Die
Zona pellucida schützt die wachsende Eizelle und den jungen –
noch nicht implantierten – Embryo vor mechanischen und anderen
äußeren Einflüssen und vermittelt, wie eine Mailbox, den Kontakt
zwischen Embryo und der mütterlichen Umgebung. Darüber hinaus
erkennt das befruchtungskompetente Spermatozoon über die Zona
pellucida seine Eizelle und nimmt den ersten Kontakt zu ihr auf. Im
Gegenzug dazu steuert die Zona pellucida die Funktion des Spermatozoons,
sodass es diese äußere Eihülle durchdringen und
schließlich die Eizelle befruchten kann.
Die Folge dieser verschiedenen Schritte der Befruchtungkaskade
sind in Abbildung 1 dargestellt. Zunächst müssen die Spermatozoen,
die nach der Insemination in den Eileiter gelangt sind, in einen
aktiven befruchtungsfähigen Zustand versetzt werden – eine
Sequenz äußerst komplizierter endogener Vorgänge, die unter dem
Begriff Kapazitation zusammengefasst werden. Das kapazitierte
Spermatozoon ist nun in der Lage, der ovulierten Eizelle zum Ort
der Befruchtung (der Übergang von Isthmus zur Ampulle des Eileiters)
entgegen zu schwimmen, die Eizelle an der Zona pellucida zu
erkennen und an diese zu binden. Bei dem gebundenen Spermatozoon
induziert die Zona pellucida nun über Signaltransduktionskaskaden
den massiven Influx von Kalziumionen in die Zelle; dieser
löst dann die so genannte Akrosomreaktion, die Exozytose des
Akrosoms, aus. Durch die Akrosomreaktion wird der enzymatische
Inhalt des Akrosoms, das einen Teil des Spermatozoonkopfes
umgibt (Abb. 1), ausgeschüttet, und trypsinähnliche Proteinasen,
wie beispielsweise das akrosomale Akrosin, hydrolisieren sehr lokal
Summary
The oocyte zona pellucida plays an essential role in the regulation
of fertilization. The carbohydrate-mediated recognition of
both gametes is a crucial step of the fertilization cascade and has
been one of the main topics of reproductive biology in the past
decade. The current project focus on the characterization of the
glycans of the porcine zona pellucida (glycomics), their structural
changes, as well as the global changes in the three-dimensional
architecture of the ZP during oocyte maturation in relation to zona
pellucida function. Knowledge of the maturation process of the
zona pellucida is of interest for optimizing the in-vitro production
of porcine embryos.
die Zona pellucida. Den sich bildenden Schlitz kann das Spermatozoon
nun mit Hilfe seiner eigenen Beweglichkeit durchdringen und
gelangt in den perivitellinen Raum. Das ist der Raum zwischen Zona
pellucida und der eigentlichen Eizelle. Es dockt im nächsten Schritt
an die Plasmamembran der Eizelle an, fusioniert mit dieser und
wird in das Zytoplasma der Eizelle gezogen, wobei der Kern des
Spermatozoons zu dekondensieren beginnt und den männlichen
Vorkern bildet. Bei der Fusion werden neben der Aktivierung der
Kernreifung und des embryonalen Entwicklungssystems auch
Mechanismen eingeleitet, die zum so genannten Polyspermieblock
führen. Dieser soll verhindern, dass mehr als ein Spermatozoon in
die Eizelle eindringen kann. Bei der reifen, befruchtungsfähigen
Eizelle sind unterhalb der Plasmamembran kleine Organellen – die
Abb. 1: Die Befruchtungskaskade. Das kapazitierte Spermatozoon (Akrosom:
rot) bindet an die Zona pellucida (grün). Die Akrosomreaktion wird ausgelöst und
das akrosom-reagierte Spermatozoon penetriert die Zona pellucida. Durch die
Fusion mit der Eizelle kommt es zur Exozytose der kortikalen Granulae (grau);
durch deren Inhalt die Zona Reaktion eingeleitet wird.

Karl-Eibl-Str. 17–27 · 91413 Neustadt
Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Mariensee (FAL)
Zentrum für Frauenheilkunde und Zentrum für Anatomie der Georg-August-Universität Göttingen
kortikalen Granulae – angeordnet (Abb. 2),
die bei Fusion von Spermatozoon und Eizelle
ihren Inhalt in den perivitellinen Raum ausschütten.
Proteinasen, Glycosidasen, Lektine
und viele andere kortikale Inhaltsstoffe verändern
die Struktur der Zona pellucida in einer
Weise, dass nachfolgende Spermatozoen
nicht mehr an die Zona pellucida binden oder
diese nicht mehr penetrieren können. Diese
Strukturveränderung der Zona pellucida wird
als Zona Reaktion oder Zona hardening
bezeichnet. Interessanterweise kann man
Spermatozoen auch außerhalb des Eileiters
in künstlichen Medien kapazitieren und
schließlich sogar eine Eizelle befruchten.
Damit sind die Voraussetzungen für die so
genannte In-vitro-Fertilisation (IVF-)Techniken
gegeben, die seit vielen Jahren nicht nur
beim Menschen, sondern auch beim Nutztier
eine wichtige Rolle spielen. Beim Menschen
wird die Technik zur Behandlung von Kinderwunschpatienten eingesetzt,
bei Nutztieren zur assistierten Fortpflanzung.
Die Zona pellucida
Die Zona pellucida (ZP) ist, gemessen an ihren vielfältigen Aufgaben,
einfach zusammengesetzt. Sie besteht aus drei Glykoproteinen,
die entsprechend ihrer Gene als ZPA- (das größte Gen), ZPBund
ZPC-Proteine benannt werden (Abb. 3a). Sie sind nicht nur
innerhalb der Säuger hoch konserviert. Die Eihüllproteine anderer
Vertebraten, wie beispielsweise die vom Krallenfrosch, von Fischen
oder von Hühnern, gehören zu den gleichen Proteinfamilien.
Gemeinsam ist allen Zona- und Eihüllproteinen eine etwa 260 Aminosäure
lange so genannte ZP-Domäne, die für die Filamentbildung
der Zona-Proteine und damit für den netzartigen Aufbau dieser
extrazellulären Matrix verantwortlich ist. Die ZP-Proteine werden im
Ihr bewährter Partner für
Darstellung der kortikalen Granulae
Wesentlichen von der Eizelle selbst synthetisiert
und während ihres Wachstums
sezerniert. Bei größeren Tierarten, wie
Schweinen und Rindern, tragen auch
die die wachsende Eizelle umgebenden
Granulosazellen zur Synthese und dem
Aufbau der dreidimensionalen Struktur
der Zona pellucida bei.
Das große ZPA-Protein spielt bei dem
Block gegen Polyspermie eine besondere
Rolle, da es nach der Befruchtung
durch Enzyme der kortikalen Granula
gespalten und damit eine weitere Vernetzung
der Proteine begünstigt wird.
Die Zona pellucida wird dadurch weitgehend
undurchlässig für weitere eindringende
Spermatozoen. Für die erste
Kontaktaufnahme und Erkennung von
Spermatozoon und Eizelle sind je nach
Tierart die beiden anderen ZP Proteine, ZPC (Maus) und ZPB im
Komplex mit ZPC (Schwein), verantwortlich. Für die meisten anderen
Tierarten ist der Spermienrezeptor der Zona pellucida noch
nicht eindeutig bestimmt. Definierte Kohlenhydrate der entsprechenden
Glykoproteine, die in der dreidimensionalen Struktur der
ZP in der richtigen Weise nach außen gerichtet sind, können nun
von Lektin-ähnlichen Proteinen, die auf der Oberfläche des Spermatozoonkopfes
lokalisiert sind, erkannt werden. Die Spermatozoen
binden an die Matrix, und es werden die weiteren Schritte der
Befruchtungskaskade eingeleitet (Abb. 1). Die Erkennung beider
Gameten und die Bindung eines Spermatozoons an die Zona pellucida
sind also Voraussetzung für die Befruchtung der Eizelle.
Abb. 2: Darstellung der kortikalen Granulae im
konfokalen Mikroskop. Die kortikalen Granulae
sind 120 min nach Beginn der In-vitro-Befruchtung
mit FITC-PNA angefärbt.
• Spitzengenetik von Bullen und Ebern
• Fruchtbarkeitsberatung und
-schulung
• Trächtigkeitsuntersuchung
mit dem Scanner
• Embryotransfer auf höchstem Niveau
Die Identifizierung der Kohlenhydratstrukturen, ihre Lokalisation
entlang der Polypeptidketten und die Definition der an der Erkennung
und Bindung beteiligten Kohlenhydrate der Zona pellucida
sind daher schon lange ein Anliegen der Reproduktionsbiologen.
E-Mail: info@bvn-online.de · Internet: http://www.bvn-online.de
Telefon: 09161 / 787 - 0 · Fax: - 2 50
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Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Mariensee (FAL)
Zentrum für Frauenheilkunde und Zentrum für Anatomie der Georg-August-Universität Göttingen
Die Kohlenhydrate der Zona pellucida des Schweins
Die Analyse der Kohlenhydrate in Gykoproteinen stellt den Analytiker
wegen des hohen Materialbedarfs und der normalerweise
außerordentlichen Heterogenität der Kohlenhydratseitenketten
(Glykane) vor besondere Probleme. Erst mit der Entwicklung der
Massenspektrometrie, hier insbesondere der Entwicklung der
„Matrix-unterstützten Laserdesorption/Ionisation Massenspektrometrie
(MALDI-MS), gelingt es, auch mit geringeren Ausgangsmengen
Glykoproteine zu analysieren. In den neunziger Jahren ist es
M. Nakano, Chiba Universität, Japan, gelungen, die Glykane der
beiden Glykoproteine ZPB und ZPC vollständig in ihrer Struktur aufzuklären,
ihre Verteilung entlang der Moleküle zu bestimmen und
die Struktur und Lokalisation der für die Gametenerkennung verantwortlichen
Glykane zu identifizieren. Die Glykoproteine der porzinen
Zona pellucida sind mit einem Kohlenhydratanteil von etwa 30%
hochglykosyliert. Sie enthalten Glykane, die über die Aminosäuren
Asparagin oder Serin/Threonin verknüpft sind und kurz als N-Glykane
bzw. O-Glykane bezeichnet werden. Die N-Glykane gehören
dem so genannten komplexen Typus an. N- und O-Glykane können
durch sulfatierte Lactosamineinheiten und Neuraminsäuren verlängert
sein (Abb. 3b). Durch die Vielzahl der Modifizierungen sind die
Kohlenhydratstrukturen der ZP außerordentlich heterogen. Es sind
daher nur die häufigsten Glykanstrukturen der porzinen Zona pellucida
in Abbildung 3b schematisch dargestellt.
Auf der Basis dieser Arbeiten konnten nun mittels moderner massenspektrometrischer
Methoden die Kohlenhydratmuster (glycan
profiles) des großen ZPA-Proteins bestimmt und ihre Veränderungen
während Wachstum und Reifung der Eizelle verfolgt werden.
Zona pellucida Glycomics
Die im Wesentlichen massenspektrometrische Analyse der Glykane
in Glykoproteinen wird in Analogie zur proteomics auch glycomics
genannt. Die Untersuchung der Zona pellucida folgt der Methodik
Abb. 3:
a) Die Domänenstruktur der reifen Glykoproteine der Zona pellucida des
Schweins. Die Glykosylierungen sind mit Symbolen dargestellt (für eine Erklärung
siehe Abbildung 2b). Schwarze Balken symbolisieren die Lokalisation der
Cysteinreste. bezeichnet die nicht besetzte potentielle Glykosylierungsstelle
in ZPA.
von glycomics und soll hier kurz schematisch dargestellt werden
(Abb. 4a). Nach elektrophoretischer Trennung von ZPA werden im
Gel die Kohlenhydratseitenketten durch spezifische Enzyme (endo-
Glykosidasen) abgespalten, die freien Glykane aus dem Gel gelöst
und nach Reinigung im MALDI-MS analysiert. Alternativ wird das
Protein im Gel selbst mit Proteasen (vorwiegend Trypsin) gespalten,
die entstehenden Peptide und Glykopeptide aus dem Gel
gelöst und dann ebenfalls massenspektrometrisch analysiert. Dieses
Vorgehen erlaubt die Erstellung der Glykanmuster (glycan profiling,
Abb. 4b) und die Lokalisation der Glykane innerhalb des
Moleküls. Für ZPA konnte damit gezeigt werden, dass dieses Protein
neben den vorher beschriebenen komplexen N-Glykanen eine
weitere Glykanstruktur trägt, die als Oligomannosyl-Glykan
bezeichnet wird (Abb. 3b). Außerdem konnte gezeigt werden, dass
nur fünf der sechs potentiellen Glykosylierungsstellen tatsächlich
Glykane tragen.
Die Reifung der Zona pellucida
Zyklusabhängig wächst die Eizelle im Follikel heran. Zu diesem
Zeitpunkt hat sie die Reduktionsteilung (Meiose) noch nicht vollständig
durchgeführt, d.h. sie hat ihren doppelten Chromosomensatz
(die mütterlichen und väterlichen Chromosomenpaare) noch
nicht vollständig halbiert. Das gelingt erst mit der Ovulation und der
nachfolgenden Befruchtung selbst. Befruchtungskompetent ist nur
die ovulierte, gereifte Eizelle. Die Reifung der Eizelle kann ebenfalls,
wie die eigentliche Befruchtung, in vitro durchgeführt werden
(In-vitro-Maturation, IVM). Es stellte sich nun die Frage, ob es
neben der Reifung des Eizellkerns, des Zytoplasmas und der intrazytoplasmatischen
Organellen auch zu reifungsbedingten Veränderungen
der extrazellulären Matrix kommt. Vergleicht man die Eigenschaften
der Zona pellucida „ungereifter“ Eizellen, die aus Follikeln
gewonnen wurden, mit denen, die einer 2-tägigen In-vitro-Reifung
unterworfen wurden, lassen sich einige entscheidende Unterschiede
feststellen. So hat sich die Kommunikationsfähigkeit mit der
Samenzelle während der Reifung deutlich erhöht. Die von der Zona
b) Die häufigsten Glykane der porzinen Zona pellucida. Die Symbole charakterisieren
bi- (blau), tri- (grau) und tetra- (rot) antennäre komplexe N-Glykane
sowie Oligomannose-Typ N-Glykane (grün).

Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Mariensee (FAL)
Zentrum für Frauenheilkunde und Zentrum für Anatomie der Georg-August-Universität Göttingen
Abb. 4:
a) Schema der Strategie für die Glykananalyse der Proteine der porzinen
Zona pellucida.
pellucida induzierte Akrosomreaktion der gebundenen Spermatozoen
läuft deutlich schneller und effizienter ab. Elektrophoretische und
rasterelektronenmikroskopische Analysen der ZP zeigten, dass
diese Funktionalität von einer Erhöhung des Anteils der sauren sulfatierten
Glykane und einer feineren dreidimensionalen Architektur
der Zona pellucida begleitet ist. Zusätzlich unterscheiden sich diese
Parameter in einer in-vitro-gereiften von denen einer in-vivo-gereiften
Zona pellucida.
Ausblick
Die Kenntnis der Funktionskapazität der Zona pellucida ist von
besonderem Interesse für die Optimierung der In-vitro-Produktion
von Schweineembryonen. Die ersten Analyseergebnisse über Bau
und Funktion des Zona Glykoproteins ZPA deuten auf eine insuffiziente
Funktion im In-vitro-System hin, das für polysperme Befruchtungen,
die nicht zur Fortpflanzung führen können, mit verantwortlich
ist. Zusätzlich spielen aber auch die zeitgerechte Ausschüttung
des Inhaltes der kortikalen Granula (Abb. 2) und die Integrität der
Spermienmembranen eine entscheidende Rolle bei der polyspermen
Befruchtung. Auch wenn mit den hier beschriebenen Untersuchungen
einige Bausteine der Befruchtungsvorgänge gefunden
wurden, ist das In-vitro-System noch weit von den natürlichen Vorgängen
entfernt und bedarf intensiver Forschungsarbeiten. Dies
gilt, wenn auch in unterschiedlichem Umfang, ebenfalls für die Invitro-Techniken
anderer Nutztierspezies.
b) Glycan Profiling von ZPA durch MALDI-MS. Die Glykanstrukturen sind über
den entsprechenden Massenpeaks angegeben.
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Friederike Gethöffer
Einleitung
Institut für Wildtierforschung der TiHo (Arbeitsgruppe Prof. Dr. Klaus Pohlmeyer, Dr. Gunter Sodeikat)
Zur erfolgreichen Fortpflanzung von Wildschweinen
Zusammenfassung
Die Bestände des europäischen Wildschweins in Mitteleuropa
sind in den letzten Jahren stark angewachsen. In einer 2-jährigen
Untersuchung am Institut für Wildtierforschung wurde die
Fortpflanzungsleistung dieser Wildtiere kontrolliert. Dazu wurden
Ovarien und Uteri aus einem niedersächsischen und zwei rheinland-pfälzischen
Gebieten gewonnen, in denen die Klassische
Schweinepest (KSP) bei Wildschweinen aufgetreten ist. Untersuchungen
von Blutproben gaben zudem Aufschluss über das
Vorhandensein von Erkrankungen, die Auswirkungen auf das
Reproduktionsgeschehen der Sauen haben können.
Die Ergebnisse zeigen, dass exogene Faktoren sowohl den Zeitpunkt
der Fortpflanzung im Jahresverlauf als auch die Gesamtbeteiligung
der Tiere an der Reproduktion stark beeinflussen.
Neben hohen Ovulationsraten, Fetenzahlen und Trächtigkeitsprävalenzen
aller Altersklassen konnte bei Jungtieren eine frühe
Geschlechtsreife mit anschließender Trächtigkeit festgestellt werden.
Das europäische Wildschwein (Sus scrofa), zu dem derzeit 14
Unterarten gerechnet werden, sorgte in der jüngeren Vergangenheit
durch anhaltend hohe Vermehrungsraten für Aufmerksamkeit. Das
natürliche Vorkommen dieser Wildart erstreckt sich von Westeuropa
über Asien bis nach Japan. In Australien, Neuseeland sowie
Nord- und Südamerika ist es, nach Aussetzung von Menschenhand,
ebenfalls verbreitet. In Mitteleuropa nehmen die Bestände
des in Deutschland als Schwarzwild bezeichneten Wildtiers stetig
zu. Die Streckenzahlen, also die Zahlen der von Jägern erlegten
Tiere, die noch immer als einziger Indikator zur Einschätzung der
Bestände herangezogen werden
können, zeigen seit dem Ende des
zweiten Weltkrieges ein ununterbrochenes
Wachstum (Abb.1).
Die Gründe für diesen Populationsanstieg
sind vielfältig. Neben hervorragenden
Umweltbedingungen, milden
Wintern, einem ausreichenden
Futterangebot sowie einer geringen
Zahl von natürlichen Feinden geben
Untersuchungen von Reproduktionsparametern
seit den 1950er Jahren
gleichzeitig Hinweise auf eine
zunehmende Fortpflanzungsleistung
des Wildschweins. Die starke Vermehrung
der Tiere wird zum Teil als
Summary
Recent increases in wild boar populations in central Europe
necessitated evaluation of the current reproductive performance
of this species.
During a two-year study, samples of ovaries and uteri were taken
from wild boars from areas in Lower Saxony and Rhineland-
Palatinate, Germany (“Westeifel” and “Pfälzerwald”, respectively),
in which wild boar have been vaccinated against CSF following
several outbreaks of the disease. Serum samples were also
analyzed to determine the prevalence of diseases that may influence
pig reproduction and fertility.
Our results indicate that exogenous factors have a strong impact
on both reproductive seasonality and the percentage of reproducing
individuals in an age class. Ovulation rates, numbers of fetuses
and prevalence of pregnancies were found to be high among
all age classes, while early onset of puberty and high pregnancy
rates were typical of young animals.
problematisch angesehen. Abgesehen von einer erhöhten Unfallgefahr
sowie Schäden in der Infrastruktur birgt die hohe Wildschweindichte
auch epidemiologische Risiken. KSP ist insbesondere in
Wildschweinbeständen mit hoher Wilddichte und hohen Reproduktionsraten
endemisch. Mehreren Untersuchungen zufolge ist eine
Vielzahl der Primärausbrüche von KSP beim Hausschwein auf Kontakte
zu Sus scrofa zurückzuführen.
Fragestellungen zur Wildschweinreproduktion
Die Seuchenzüge der KSP in niedersächsischen und rheinlandpfälzischen
Wildschweinpopulationen geben daher Anlass, die
Reproduktionsparameter des Wildschweins in diesen Regionen
Abb. 1: Entwicklung der Schwarzwildstrecke in Deutschland von 1960-2004

Institut für Wildtierforschung der TiHo (Arbeitsgruppe Prof. Dr. Klaus Pohlmeyer, Dr. Gunter Sodeikat)
Abb. 2: Verteilung der Geburtstermine im Jahresverlauf (Okt. 2003 bis Sept. 2004) von Wildschweinen der rheinland-pfälzischen Untersuchungsgebiete (Altersklasse
1=Frischlinge, 2=Überläufer, 3=Mehrjährige; Untersuchungsgebiet 2=westliche Eifel, 3=Pfälzerwald)
erneut zu untersuchen. Unter anderem wurde geprüft, inwieweit der
Beginn der Geschlechtsreife und die erste Trächtigkeit von Alter und
Gewicht der Wildschweine abhängig ist. Ein weiterer Focus lag auf
der jahreszeitlichen Reproduktionsaktivität der Tiere.
Insbesondere die für Wildtiere typische Saisonalität der Fortpflanzung,
die durch Faktoren wie Tageslichtlänge, Temperatur und Nahrungsangebot
beeinflusst wird, ist wegen der starken Vermehrung
des Schwarzwildes oft in Frage gestellt worden. Ganz wesentlich
ist, herauszufinden, in welchem Alter sich die Wildschweine fortpflanzen.
Vor allem ist der Anteil der sich reproduzierenden Jungtiere
interessant. Frischlinge, die Ferkel des Wildschweins, machen
den größten Anteil der demographischen Struktur aus – ob sie aber
tatsächlich nennenswerten Zuwachs beisteuern, ist umstritten.
Sicher ist, dass vor allem Tiere der Jugendklasse von KSP-Infektionen
betroffen sind, so dass eine Quantifizierung des potentiellen
jährlichen Zuwachses notwendig ist.
Neue Ergebnisse zu dieser Thematik liefert die am Institut für Wildtierforschung
im Rahmen einer Dissertation durchgeführte Untersuchung.
Uteri und Ovarien von erlegten Wildschweinen aus zwei
rheinland-pfälzischen sowie einem niedersächsischen Untersuchungsgebiet
bilden das Untersuchungsmaterial der über einen
Zeitraum von zwei Jahren durchgeführten Arbeit. Anhand der
Zuordnung ovarieller Zyklusstadien konnte die jahreszeitliche
Reproduktionsaktivität der Tiere in der Stichprobe skizziert werden.
Die Scheitel-Steiß-Länge sowie das Gewicht von Wildschweinfeten,
die in der Gebärmutter von geschossenen Tieren vorgefunden wur-
den, geben Anhaltspunkte über den Zeitpunkt der Bedeckung des
Muttertieres und dienen zur Berechnung des Geburtstermins.
Saisonal, frühreif und hocheffektiv
Die Untersuchung zeigt, dass die Saisonalität für die Fortpflanzung
der Wildschweine noch immer von erheblicher Bedeutung ist. Die
Hauptreproduktionszeit beginnt mit der Rausche, der Begattungszeit,
in den Monaten November und Dezember und endet in gestaffelten
Wurfterminen in den Frühjahrsmonaten. Ein beachtlicher Teil
weiblicher Individuen der Jugendklasse weicht allerdings von diesem
Rhythmus ab. Während mit hoher Wahrscheinlichkeit mehr als
zwei Drittel der Jungtiere bereits im Alter von 8 - 12 Monaten zur
„Hauptsaison“ erfolgreich gedeckt wurden, waren weitere 15% dieser
Altersklasse in den Sommermonaten tragend, wie in den rheinland-pfälzischen
Untersuchungsgebieten gezeigt werden konnte
(Abb. 2). So entstand in den rheinland-pfälzischen Wildschweinpopulationen
während der Sommermonate ein zweites Geburtenmaximum.
Paarungstermine, die sich außerhalb dieser Zeiträume
befinden, konnten nur für weniger als 10% der Stichprobe ermittelt
werden. Allerdings weisen die Ovarien der Tiere mehrheitlich auch
während der Sommermonate sowohl Follikel von präovulatorischer
Größe als auch Gelbkörper auf.
Die ermittelten Ovulationsraten und Fetenzahlen der Wildschweine
in den drei Untersuchungsgebieten übertreffen die im innerdeutschen
und europäischen Vergleich bisher bekannten Werte. Diese
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34
Institut für Wildtierforschung der TiHo (Arbeitsgruppe Prof. Dr. Klaus Pohlmeyer, Dr. Gunter Sodeikat)
Fruchtbarkeitsmerkmale sind multifaktoriell beeinflusst. Ihre Untersuchung
hat zudem signifikante Altersunterschiede ergeben. So
weisen Frischlinge in Niedersachsen bereits durchschnittlich 5,2
Feten im Uterus auf, für zwei- und mehrjährige Tiere werden 6,7
und 7,6 Feten im arithmetischen Mittel errechnet. Im Gegensatz
hierzu erzielt die embryonale Mortalität, die der Literatur zufolge
beim Wildschwein 25% und mehr erreichen kann, in den untersuchten
Populationen mit 6% bis 18% Minimalwerte.
Auch das Eintrittsalter von Frischlingen in die Geschlechtsreife
scheint geringer zu sein als bisher angenommen. In den untersuchten
Regionen besteht eine 80%ige Wahrscheinlichkeit für Frischlinge,
in einem Alter von acht Monaten die Pubertät erreicht zu haben.
Dabei erweist sich das Körpergewicht der Tiere als wesentlicher
Einflussfaktor. Ab einem Aufbruchgewicht von 20 kg, das circa 75%
des Lebendgewichtes entspricht, konnten mehr als zwei Drittel der
untersuchten Tiere als geschlechtsreif eingestuft werden. Da ein so
komplexes biologisches Ereignis wie die Pubertät nicht allein an
Ovarbefunden festzumachen ist, kann in diesem Zusammenhang
die Zahl der tatsächlich tragenden Frischlinge im weiteren Reproduktionsgeschehen
als zusätzlicher Beweis gelten. Das Minimalgewicht
tragender Jungtiere beträgt 22 kg (Aufbruchgewicht).
Zu den Umweltfaktoren, die wesentlichen Einfluss auf die Reproduktion
des Schwarzwilds haben können, gehört die Nahrungsverfügbarkeit.
Obwohl in den drei untersuchten Gebieten aufgrund der Vegetationsstruktur
und der landwirtschaftlichen Verhältnisse von einer
guten Ernährungsgrundlage für Wildschweine ausgegangen werden
kann, haben Baummasten, insbesondere die Fruktifizierung von
Eichen und Buchen, Auswirkungen auf die Fortpflanzung der Sauen
gezeigt. Im zweiten Untersuchungsjahr wurde im Untersuchungsgebiet
der westlichen Eifel (Rheinland-Pfalz) eine Vollmast, also ein
besonders ertragreiches Jahr, für Eichen und Buchen festgestellt.
Die anschließende Reproduktionsphase des Schwarzwilds begann
ungefähr vier Wochen früher als im Vorjahr und zeigte eine Trächtigkeitsrate
der zwei- und mehrjährigen Tiere von 100% (Abb. 3).
Ein weiteres Augenmerk
der Untersuchung lag auf
Erkrankungen, die Auswirkungen
auf das Reproduktionsgeschehen
der Wildschweine
haben können. In
stratifizierten serologischen
Untersuchungen auf Antikörper
gegen die Aujeszky`sche
Krankheit, Brucellose,
KSP, Porcine Parvovirose
sowie PRRS (Porcines
Reproduktives und Respiratorisches
Syndrom) wurde
in den drei Regionen ein
hoher Durchseuchungsgrad
der Wildschweinpopulationen
mit Porcinem Parvovirus
festgestellt. Zudem weisen
mehrere Seren von Tieren
eines rheinland-pfälzi-
Abb. 3: Ovarbefunde von Wildschweinen eines rheinland-pfälzischen Untersuchungsgebietes während eines normalen und
eines Mastjahres
Abb. 4: Nur im Winter, insbesondere im
November und Dezember, gesellen sich
die alten Keiler zu den Bachen; Foto:
Copyright: Goldmann
schen Untersuchungsgebietes zusätzlich Antikörper gegen den
Erreger der Aujeszky`schen Krankheit auf. Weder pathologische
Organveränderungen noch abnorme Embryonal- oder Fetalstadien
geben Anlass, ein erhöhtes Vorkommen der Erkrankung in diesen
Populationen zu vermuten. Lediglich eine geringfügig erhöhte
embryonale Mortalität unter mehrjährigen Tieren der Stichprobe im
Vergleich zu den übrigen Gebieten macht einen Einfluss der Erkrankung
auf die Fortpflanzungsleistung wahrscheinlich.
Die Analyse der Untersuchungsgebiete hinsichtlich Nahrungsverfügbarkeit,
Vegetation, klimatischer Verhältnisse und weiterer Komponenten
veranschaulicht, dass das Wildschwein sich sowohl als
reiner Waldbewohner als auch in der Rolle des Kulturfolgers in
Großstädten erfolgreich fortpflanzt. Neben einem hohen Reproduktionspotential,
das bei einer idealen Populationsstruktur eine Vermehrungsrate
von mehr als 200% gewährleistet, weisen die untersuchtenWildschweinbestände
einen hohen Anteil
reproduzierender Frischlinge
auf.

Andreas Spötter, Ottmar Distl
Wurfgröße beim Schwein – bestimmende Faktoren
und Rasseunterschiede
Die Anzahl lebend geborener Ferkel wird von zahlreichen Faktoren,
wie Ovulationsrate, embryonaler Überlebensrate und Uteruskapazität,
bestimmt. Die Anzahl ovulierter Eizellen (= Ovulationsrate)
bestimmt die maximale Wurfgröße. Bei steigenden Ovulationsraten
nimmt jedoch die pränatale Überlebensrate ab und ist als limitierender
Faktor anzusehen. Eine Steigerung der Wurfgröße über eine
Verminderung dieser Verluste scheint daher ein viel versprechender
Ansatz zu sein. Für die Schweinezucht ist es wichtig, zu erfahren,
welche Faktoren die Wurfgröße regulieren und wie sich diese
Erkenntnisse in der Zucht praktisch nutzen lassen.
Das chinesische Meishan Schwein (Abb. 1) ist für seine hohe
Fruchtbarkeit bekannt. Im Vergleich mit westlichen Schweinerassen
Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der TiHo
Genetische Ursachen der Wurfgröße beim Schwein
Zusammenfassung
Die Wurfgröße beim Schwein wird wesentlich von der embryonalen
Sterblichkeit bestimmt. Diese ist während der ersten
Wochen der Trächtigkeit am höchsten und wird auf Störungen
bestimmter embryonaler Entwicklungsprozesse zurückgeführt.
Um die Wurfgröße zu erhöhen, wird bisher meist auf phänotypische
Informationen und eine Zuchtwertschätzung für die Anzahl
lebend geborener Ferkel zurückgegriffen. Ein anderer Ansatz verwendet
molekulargenetische und phänotypische Informationen
gleichzeitig. Dementsprechend gehen viele Forschungsarbeiten
dahin, Gene zu identifizieren und deren Expressionsmuster
aufzuklären, die einen Einfluss auf die Befruchtung, embryonale
Implantation und weitere fetale Entwicklung haben. Das Ziel
dieses Artikels ist es, einen Überblick über den Stand dieses
Forschungsgebiets zu geben.
Abb. 1: Meishan oder Chinesisches Faltenschwein
Summary
One of the major determinants for litter size in pigs is prenatal
mortality. It occurs most frequently during the first few weeks of
gestation and can be attributed to disturbances in developmental
processes during embryogenesis. Improvement of litter size has
been attempted using phenotypic data and prediction of breeding
values. However, another promising approach in pursuit of this
aim has been the use of molecular genetic information to
increase embryonic survival. Accordingly, considerable efforts
have been made in identifying and mapping genes involved in the
regulation of fertilization, embryo implantation and fetal development
and in elucidating their expression patterns.
The objective of this paper was to give an overview of the efforts
being made and approaches being used in this field.
hat es bei vergleichbaren Ovulations- und Befruchtungsraten durchschnittlich
3,6 lebend geborene Ferkel mehr pro Wurf sowie eine
höhere Anzahl von Zitzenpaaren.
Die pränatalen Verluste sind beim Schwein während des ersten
Monats der Trächtigkeit mit 20 bis 30% der ovulierten Eizellen doppelt
so hoch, wie für den restlichen Zeitraum der Trächtigkeit (85
Tage), da die Implantation des Embryos in die Gebärmutterschleimhaut
eine sehr kritische Phase für das weitere Überleben darstellt.
Diese Phase wird von einer größeren Anzahl von Genen gesteuert
und Mutationen in einzelnen Genen können bereits zu erheblichen
Veränderungen in der Frequenz pränataler Verluste führen.
Die Rolle genetischer Marker bei der Erforschung der
Wurfgröße
Molekulargenetische Methoden, insbesondere der Einsatz genetischer
Marker wie Mikrosatelliten und Single Nucleotide Polymorphisms
(SNPs), sind von großer Bedeutung bei der Identifizierung
reproduktionsrelevanter Gene und der Selektion von Zuchttieren.
Mikrosatelliten bestehen aus Wiederholungen von zwei oder mehr
Basenpaaren (z.B.: (GT) n ). Die Anzahl der Wiederholungen ist
variabel, d.h. sowohl einzelne Individuen als auch die beiden Allele
eines Individuums können sich durch die Anzahl der Wiederholungen
unterscheiden (Abb. 2). Die Anzahl möglicher Allele ist je nach
Mikrosatellit sehr verschieden und kann zwischen 1 und bis zu 20
liegen. Die Nutzbarkeit eines Mikrosatelliten für die Selektion ergibt
sich dann, wenn er in unmittelbarer Nähe eines Gens liegt, das für
die Fruchtbarkeit von Bedeutung ist. In diesem Fall ist der Mikrosatellit
mit dem fruchtbarkeitsrelevanten Gen genetisch gekoppelt und
somit eine Trennung dieser beiden Genorte durch Crossing-over
während der Meiose wenig wahrscheinlich.
35

36
Eine zweite Klasse genetischer Marker, SNPs, kommt überall im
Genom vor, also auch innerhalb von Genen, und hat gegenüber
Mikrosatelliten den Vorteil, dass sie wesentlich häufiger auftreten,
d.h. leichter zu finden sind. SNPs sind Einzelbasenaustausche an
bestimmten Stellen im Genom (z.B. ein Adenin für ein Cytosin,
Abb. 3). Da die meisten SNPs diallel sind, sind sie weniger informativ
als Mikrosatelliten, d.h. die Vererbung der Allele eines SNP von
den Eltern auf die Nachkommen lässt sich nicht immer nachvollziehen.
Dieser Nachteil lässt sich jedoch durch die Verwendung mehrerer
unmittelbar benachbarter SNPs ausgleichen.
Die Genotypisierung, d.h. der Allelnachweis für genetische Marker,
erfolgt z.B. über eine Sequenzierung des entsprechenden Genomabschnitts
für das jeweilige Individuum, eine Minisequenzierung
(SNaPshot Methode), durch PCR (Polymerase Chain Reaction)
und anschließender gelelektrophoretischer Auftrennung des Polymorphismus
(Abb. 2) oder durch einen PCR gestützten „Restriction
Fragment Length Polymorphism“ (PCR-RFLP, Abb. 3). Eine Selektionsentscheidung
anhand eines Genotypisierungsergebnisses ist
im Gegensatz zur phänotypischen Selektion bereits sofort nach der
Geburt möglich, wodurch das Generationsintervall verkürzt wird.
Des Weiteren kann der Genotyp in beiden Geschlechtern nachgewiesen
werden und ist damit der Selektion leichter zugänglich.
Merkmalsassoziierte intragenische oder eng gekoppelte Marker
können über die Untersuchung von Kandidatengenen identifiziert
Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der TiHo
Abb. 2: Genotypisierung eines Mikrosatellitenmarkers. Der Nachweis der zwei verschiedenen Allele eines jeden Tieres geschieht in zwei Schritten. Zuerst wird der
den Marker enthaltende Genomabschnitt über eine PCR amplifiziert. Anschließend erfolgt eine elektophoretische Auftrennung der PCR Produkte in einem 6 %igen
Polyacrylamidgel.
werden. Dieser Ansatz und die damit erzielten Ergebnisse werden
anschließend näher erläutert.
Kandidatengene für die Wurfgröße beim Schwein
Es gibt verschiedene Kriterien für die Wahl eines Gens als Kandidatengen
für ein bestimmtes Merkmal, die es zur weiteren Untersuchung
mit dem Ziel der Bestätigung oder Verwerfung dieses Verdachts
qualifizieren. Gene von denen bekannt ist, dass sie eine
wichtige physiologische Rolle bei der Steuerung des jeweiligen
Merkmals bei der untersuchten Spezies oder auch einer anderen
Art spielen, werden als physiologische Kandidatengene bezeichnet.
Kandidatengene können auch aufgrund ihrer chromosomalen Lokalisation
in der Nähe von Quantitative Trait Loci (QTL, siehe folgenden
Abschnitt) für das untersuchte Merkmal ausgewählt werden
(positionelle Kandidatengene) oder aufgrund differentieller Expression
eines Gens in dem untersuchten Gewebe. Treffen mehrere Kriterien
auf ein Gen zu, erhöht dies die Chance ein merkmalsbeeinflussendes
Gen identifizieren zu können. Dieser Nachweis
geschieht über die Durchführung einer Assoziationsstudie, d.h. ein
identifizierter Kandidatengenpolymorphismus (z.B. Mikrosatellit
oder SNP) wird anhand eines Familienmaterials (z.B. Halbgeschwister)
genotypisiert und auf eine Assoziation mit dem untersuchten
Merkmal untersucht. Die Entdeckung eines signifikanten
phänotypischen Effekts eines solchen Polymorphismus auf die

Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der TiHo
Abb. 3: Genotypisierung eines SNP Markers über Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). Hierbei wird die Tatsache genutzt, dass der SNP zufällig innerhalb
der Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms DraIII liegt. Der Nachweis der zwei verschiedenen Allele eines jeden Tieres geschieht in drei Schritten. Zuerst
wird der den Marker enthaltende Genomabschnitt über eine PCR amplifiziert. Im zweiten Schritt wird das PCR Produkt mit DraIII verdaut. Abschließend werden die
Reaktionsprodukte auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt.
Wurfgröße dient als Beleg der Bedeutung dieses Gens für die Wurfgröße.
Die erste Verifizierung einer Assoziation zwischen einem Kandidatengenpolymorphismus
und der Wurfgröße beim Schwein gelang
für einen SNP im Östrogen Rezeptor 1 (ESR1) Gen, welches auf
dem Schweinechromosom (SSC) 1 lokalisiert ist. Vom Embryo
sezerniertes Östrogen ist essenziell für die Trächtigkeit, indem es
die Funktionsfähigkeit der Corpora lutea aufrechterhält. Dieser
Polymorphismus wurde in zahlreichen weiteren Studien untersucht,
wobei die an unterschiedlichen Schweinerassen nachgewiesenen
Effekte zwischen +0,3 und +1,8 Ferkeln pro Wurf schwankten bzw.
in zwei Studien kein Effekt nachgewiesen werden konnte.
Ein weiteres Kandidatengen für die Wurfgröße beim Schwein ist
das Prolactin Rezeptor (PRLR) Gen auf SSC 16, welches eine
Rolle bei der Aufrechterhaltung der Trächtigkeit spielt. Die Interaktion
von Östrogen und Prolaktin ist verantwortlich für die Umleitung
des luteolytisch (= gelbkörperauflösend) wirkenden Prostaglandin F
(PGF 2α ), so dass es seinen luteolytischen Effekt nicht über die
utero-arterielllen Gefäße ausüben kann. Für einen SNP im PRLR
Gen wurde eine Assoziation mit Unterschieden in der Wurfgröße
nachgewiesen und in unterschiedlichen anderen Studien bestätigt.
Das Retinol-Binding Protein 4 (RBP4) Gen auf SSC 14 wurde als
Kandidatengen ausgewählt, da es während der frühen Phase der
Trächtigkeit bei der Versorgung des Embryos mit Retinolsäure mit-
wirkt und ein Überangebot dieser Substanz abpuffert. Retinolsäure
wird mit der Regulierung der Gen-Transkription in Zusammenhang
gebracht. Bei der Untersuchung eines diallelen SNP in einem Intron
des Gens wurden in den ersten Studien an der Rasse Large White
und verschiedenen synthetischen Linien keine signifikanten Effekte
nachgewiesen. Beim Deutschen Edelschwein und der Deutschen
Landrasse zeigten sich jedoch deutliche Effekte des Markers auf
die Anzahl lebend geborener Ferkel.
Das Erythropoietin Rezeptor (EPOR) Gen kontrolliert Differenzierung
und Anzahl der fetalen roten Blutzellen. Die Transkription des
Gens in der fetalen Leber steigt zwischen Tag 24 und 40 der Trächtigkeit
stark an. Während dieser Periode kann es durch die zunehmende
Enge im Uterus zu Entwicklungsstörungen der Erythrozyten
im Fötus und letztendlich zu seinem Absterben kommen. Aus den
genannten Gründen wurde ein SNP im EPOR Gen auf seine Assoziation
mit Reproduktionsmerkmalen beim Schwein untersucht.
Dabei wurde ermittelt, dass der fetale Genotyp signifikant mit der
Wurfgröße und der Genotyp der Sau signifikant mit der Uteruskapazität
assoziiert sind.
Das Osteopontin (OPN) Gen auf SSC8 wird mit dem Transport und
der Pufferung von Ca 2+ vom maternalen Blutkreislauf zum Embryo
in Zusammenhang gebracht. Die Existenz von Bindestellen für
Östrogen und Glucocorticoide im Promotor des OPN Gens in Mäusen
lässt auf eine Regulierung seiner Transkription durch Steroid-
Hormone schließen, welche bekanntermaßen an reproduktionsrele-
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Klinik für Rinder und Institut für Tierzucht der TiHo
Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Mariensee (FAL)
Zentrum für Frauenheilkunde und Zentrum für Anatomie der Georg-August-Universität Göttingen
vanten Vorgängen beteiligt sind. Aus diesem Grund und der Gegebenheit,
dass die chromosomale Lokalisierung von OPN auf SSC8
mit der Position eines QTL für die Wurfgröße korrespondiert, wurde
das Gen auf seinen Einfluss auf die Wurfgröße untersucht. In zwei
Studien wurden signifikante Effekte einiger Allele eines mit OPN
gekoppelten Mikrosatellitenmarkers auf die Wurfgröße nachgewiesen.
Die Effekte des Leukemia Inhibitory Factor (LIF) auf SSC14 umfassen
Proliferation und Differenzierung von Zellen. Die essentielle
Rolle von endometrial synthetisiertem LIF auf Embryowachstum
und -implantation bei Mäusen lässt vermuten, dass dieses Gen
auch während der frühen Phase der Trächtigkeit beim Schwein
wichtige Aufgaben erfüllt. Diese Annahme wird durch die Entdeckung
der LIF Expression im Endometrium während der Zeit der
Embryoimplantation und das Vorhandensein von LIF Rezeptor
mRNA im porcinen Embryo gestützt. In einer Studie, die zum ersten
Mal den Einfluss des LIF Gens auf die Fruchtbarkeit beim Schwein
untersuchte, wurde für einen SNP im 3’-untranslatierten Bereich
des dritten LIF Exons eine signifikante Assoziation mit der Wurfgröße
nachgewiesen.
Die unterschiedlichen Resultate zwischen den verschiedenen Studien
zeigen die Schwierigkeiten, Resultate vorangegangener Studien
an einer anderen Population zu bestätigen. Selbst eine fehlende
Assoziation zwischen Kandidatengenpolymorphismus und Phänotyp
muss nicht bedeuten, dass das Genprodukt keine Bedeutung
bei der Regulierung des Merkmals hat. Vielmehr ergibt sich hieraus,
verschiedene Schweinerassen zu untersuchen und vor allem den
Stichprobenumfang groß genug zu wählen, um die Nützlichkeit
eines Markers für Zuchtprogramme, die die Steigerung der Wurfgröße
zum Ziel haben, beurteilen zu können.
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Die inkonsistenten Resultate lassen sich durch unterschiedliche
Stichprobengrößen und/oder unterschiedliche rasse- oder populationsspezifische
Allelverteilungen und das Vorhandensein unterschiedlicher
Mutationen in den einzelnen Genen erklären. Des Weiteren
wäre es denkbar, dass zwischen der ursächlichen Mutation
und dem untersuchten intragenischen Polymorphismus in dem
jeweiligen Kandidatengen unterschiedliche populationsspezifische
Kopplungsphasen vorliegen, welche durch Rekombination während
der Meiose verursacht wurden. Außerdem könnten epistatische und
pleiotrope Effekte dafür verantwortlich sein, dass ein Gen in einer
Population einen großen Effekt bewirkt, in einer anderen jedoch nur
einen kleinen.
Schlussfolgerungen
Für ein umfassendes Verständnis der Kontrolle der Reproduktion
beim Schwein ist es wichtig, in größerem Umfang weitere Kandidatengene
auf ihren Einfluss auf die Wurfgröße zu untersuchen. Bei
der Auswahl solcher Gene sind insbesondere Expressionsstudien
an Uterus, Plazenta und Embryonen vom Schwein hilfreich. Derartige
Untersuchungen wurden in den letzten Jahren in zunehmend
größerem Maßstab durchgeführt – was auf die Entwicklung neuer
Techniken, wie cDNA Microarrays, zurückzuführen ist. Als ergänzende
Auswahlkriterien dienen Informationen über die Funktion
orthologer Gene bei anderen Arten. Insbesondere für die Maus wurden
dank der Technik des Gen Knock-Outs viele Genfunktionen
aufgeklärt. Für eine Überprüfung des Einflusses dieser Gene auf
die Wurfgröße durch Assoziationsstudien wird die schnelle und kostengünstige
Entwicklung genetischer Marker wie SNPs und Mikrosatelliten
von großer Bedeutung sein. Die Markerdichte in der untersuchten
Region muss dabei so hoch sein, dass Effekte, die vom
untersuchten Gen ausgehen, von solchen Effekten unterschieden
werden können, die von eng benachbarten Genen ausgehen. Für
den Nachweis signifikanter Merkmalseffekte in Assoziationsstudien
ist weiterhin das Vorhandensein eines genügend großen Familienmaterials,
an welchem die neu entwickelten Marker genotypisiert
werden können, von hoher Bedeutung. Eine weitere Verbesserung
der Nachweisbarkeit von Effekten wird über die Genotypisierung
extremer Teilpopulationen – im Falle der Wurfgröße mit Sauen, die
stets eine große Anzahl lebend geborener Ferkel haben, und Sauen
mit einer stets kleinen Anzahl lebend geborener Ferkel – erreicht.
Für die ausgewählten Gene sind also umfassende Untersuchungen
auf DNA-, mRNA-, Protein- und Phänotyp-Ebene nötig. Hierbei werden
Techniken zur DNA Sequenzierung, Genexpressions- und
Mutationsanalyse eingesetzt, welche unter der Bezeichnung
‘functional genomics’ zusammengefasst werden. Das Ziel ist es,
diese Techniken so einzusetzen, dass möglichst viele Gene und
deren Produkte in ihren multiplen Wechselwirkungen untersucht
werden können. Die neuen Erkenntnisse aus solchen Studien werden
unser Verständnis von komplexen, d.h. von einer Vielzahl von
Genen gesteuerten, Merkmalen in Nutztierrassen erweitern. Hierdurch
sollte es dann möglich sein, die Anzahl der lebend geborenen
Ferkel und deren Überlebensrate beim Schwein zu steigern.

Einleitung
Klinik für Rinder und Institut für Tierzucht der TiHo
Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Mariensee (FAL)
Zentrum für Frauenheilkunde und Zentrum für Anatomie der Georg-August-Universität Göttingen
Heinrich Bollwein, Kathrin Herzog, Sandra Schmauder, Ulrich Baumgartner, Detlef Rath und Heiner Niemann
Einsatz der Farbdopplersonographie in der
Gynäkologie des Rindes
Zusammenfassung
Das Ziel der vorliegenden Studien war, zu überprüfen, ob die
Untersuchung des uterinen und lutealen Blutflusses mittels transrektaler
Farbdopplersonographie neue Erkenntnisse über zyklische
und pathologische Prozesse am inneren Genitale der Kuh
liefert. Sowohl die uterine als auch die luteale Durchblutung
zeigten charakteristische Schwankungen während des Zyklus,
die nur teilweise mit den Veränderungen der Sexualsteroidhormonkonzentrationen
zusammenhingen. Das künstliche Auslösen
einer Entzündung der Gebärmutterschleimhaut führte zu einem
deutlichen Anstieg des uterinen Blutflusses. Eine Stunde nach
Auflösung der Gelbkörperrückbildung mittels eines PGF2α-Analo gons war ein Anstieg in der lutealen Durchblutung bei konstant
bleibenden Progesteronwerten zu beobachten. Erst danach kam
es zu einem gemeinsamen Abfall der lutealen Durchblutung und
der Plasmaprogesteronkonzentrationen. Die Ergebnisse zeigen,
dass die Farbdopplersonographie im Vergleich zu bisherigen
Untersuchungsmethoden zusätzliche Informationen über physiologische
und pathologische Veränderungen an Uterus und
Ovarien der Kuh liefert.
Vor etwa zwei Jahrzehnten wurde die B-Mode Sonographie erstmals
in der Gynäkologie des Rindes eingesetzt. Diese Technik brachte
tief greifende Fortschritte sowohl in der Forschung als auch in der
klinischen Diagnostik mit sich, da sie die visuelle Untersuchung der
inneren Reproduktionsorgane auf nicht-invasivem Weg ermöglichte.
Die mit dieser Technik erhobenen Befunde erlauben zwar Aussagen
über die morphologische Struktur der Organe, nicht jedoch über ihre
Funktionen, wie z.B. die Blutversorgung. Blutflussstudien zur Untersuchung
der Physiologie und Pathophysiologie der Genitalorgane
werden zwar beim Rind seit langem
durchgeführt, jedoch ausschließlich experimentell
mittels invasiver Methoden. In
der Humanmedizin wird seit einigen Jahren
die Farbdopplersonographie eingesetzt,
um auf nicht-invasivem Weg die
genitale und fetale Blutversorgung zu
beurteilen. Diese Technik wird dort bereits
in der Routinediagnostik angewandt, um
bei Frauen mit Risikoschwangerschaften
den Blutfluss in der Nabelschnurarterie zu
bestimmen und dadurch frühzeitige Hinweise
auf eine eventuell unzureichende
fetale Zirkulation zu erlangen. Bei Patientinnen,
die sich einem Embryotransferprogramm
unterziehen, wird die Farb-
Abb. 1: Farbdopplersonographische Darstellung der
A. uterina dextra einer Kuh am Tag 5 post ovulationem.
In der linken Bildhäfte sind die Dopplerfrequenzverschiebungen
im Spektralmodus dargestellt, in der
rechten Bildhälfte ist der Blutfluss farbig kodiert.
Summary
The aim of the present study was to determine if the examination
of genital blood flow by transrectal colour Doppler sonography
provides new information about physiological and pathological
changes in the inner genital organs of cows. Both uterine and
luteal blood flow were found to show characteristic changes during
the oestrous cycle which were only partly related to alterations
in sexual steroid hormone levels. Artificial induction of endometritis
caused a distinct increase in uterine blood flow. One hour after
the induction of luteolysis by PGF2α there was an increase in
luteal blood flow without changes in plasma progesterone values.
Afterwards there was a simultaneous decrease in luteal blood
flow and plasma progesterone levels. These results show that,
compared to conventional methods, transrectal colour Doppler
sonography provides additional information about physiological
and pathological changes in the bovine uterus and ovaries.
dopplersonographie angewandt, um anhand der uterinen und lutealen
Durchblutung eine Prognose bezüglich der Implantation des
Embryos abzugeben. Das Ziel der vorliegenden Studien war, zu
überprüfen, ob und inwieweit mit Hilfe der transrektalen Farbdopplersonographie
beim Rind zusätzliche Informationen über physiologische
und pathologische Prozesse an den inneren Genitalien
erzielt werden können.
Grundlagen und Technik der Farbdopplersonographie
Der Doppler-Effekt, benannt nach seinem Entdecker Christian
Johann Doppler, besagt, dass sich die Frequenz einer fortlaufenden
Welle ändert, wenn Beobachter und Wellenerreger sich relativ zueinander
bewegen. Ein Beispiel für dieses Phänomen stellt ein vorbeifahrendes
Auto dar. Nähert sich das Auto, so
erhöht sich für den Beobachter die Frequenz
der vom Motor ausgehenden Schallwellen
und damit der Ton. Entfernt sich das
Fahrzeug wieder, dann erniedrigt sich die
Frequenz der Schallwellen und der Ton wird
tiefer. In der Farbdopplersonographie wird
dieses Prinzip vor allem zur Untersuchung
des Blutflusses genutzt. Treffen die von
einem in Schwingung versetzten, piezoelektrischen
Kristall ausgesendeten Ultraschall-
wellen auf die sich bewegenden Blutkörperchen,
so kommt es zu einer Frequenzänderung
der reflektierten Ultraschallwellen, der
so genannten Dopplerfrequenzverschiebung.
Ein Demodulator im Ultraschallgerät
39

40
Klinik für Rinder und Institut für Tierzucht der TiHo
Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Mariensee (FAL)
Zentrum für Frauenheilkunde und Zentrum für Anatomie der Georg-August-Universität Göttingen
vergleicht die Frequenzen der abgestrahlten und der empfangenen
Schallwellen und berechnet die Frequenzverschiebung, anhand
welcher sich wiederum die Geschwindigkeit der Blutkörperchen
bestimmen lässt. Bei Farbdopplergeräten werden die Dopplersignale
zum einen als farbkodierte Bildpunkte in ein Ultraschallbild eingeblendet,
zum anderen werden die Doppler-Spektren in Abhängigkeit
von der Zeit dargestellt und geben indirekt ein Abbild des Blutströmungsprofils
in dem betrachteten Gefäß (Abb. 1). Pulsatile Arterien
zeigen typischerweise eine biphasische Wellenform der Frequenzverschiebungen
mit einer systolischen Spitze und einem Abfall in
der Diastole.
In den letzten Jahren wurde eine neue Technik, der so genannte
Colour-Angio-Modus, im Bereich der Farbdopplersonographie entwickelt.
Hierbei wird nicht, wie bei dem herkömmlichen Verfahren,
die Geschwindigkeit, sondern die Anzahl
der pro Zeiteinheit durch ein Gefäß strömenden
Blutkörperchen farblich kodiert.
Da diese Methode gegenüber dem herkömmlichen
Verfahren eine höhere Sensitivität
bei der Sichtbarmachung des Blutflusses
besitzt, wird sie vorwiegend zur
Untersuchung der Durchblutung kleiner
Gefäße innerhalb von Organen, wie z.B.
dem Corpus luteum, eingesetzt (Abb. 2).
Quantifiziert werden kann der im Colour-
Angio-Modus erfasste Blutfluss jedoch
nicht am Farbdopplergerät selbst, sondern
nur durch die Digitalisierung der Farbbilder
und die anschließende Bestimmung der
Farbpixelzahl mit Hilfe eines computergestützten Bildanalyseprogramms.
Je mehr Farbpixelzahl ein untersuchtes Organ aufweist,
desto besser ist es durchblutet.
Uterine Durchblutung
Die uterine Perfusion wurde anhand der Blutflussgeschwindigkeit in
der A. uterina beurteilt. Dazu wurde dieses Gefäß beidseits in der
Nähe der Darmbeisäule aufgesucht, und der Blutfluss farbig sowie
in Form von Dopplerwellen dargestellt (Abb. 1).
Abb. 3: Mittlere Blutflussgeschwindigkeit (time averaged maximum velocity =
TAMV) der A. uterina während des Zyklus. Darstellung der Mittelwerte und Standardfehler
(x ± s x ) von 4 Kühen während je 2 Zyklen.* signifikanter Unterschied
zum vorhergehenden Untersuchungstag (p < 0,05).
Abb. 2: Darstellung des Corpus luteum eines Rindes
im Colour Angio Modus am Tag 10 post ovulationem.
Es zeigte sich, dass die uterine Durchblutung während des Zyklus
charakteristischen Schwankungen unterliegt (Abb. 3). Der Blutfluss
in der A. uterina war kurz nach der Ovulation (Tage 0 und 1) sehr
niedrig, stieg danach auf Maximalwerte während des Proöstrus
(Tag -3) an, um bereits an den letzten beiden Zyklustagen wieder
abzufallen. Da die Blutflussschwankungen sich nur teilweise auf die
zyklischen Änderungen der Sexualsteroidhormone zurückführen
lassen und sich in eigenen Studien gezeigt hat, dass beim Pferd
das Stickstoffmonoxydsystem eine wichtige Rolle bei der Regulation
der uterinen Durchblutung zu spielen scheint, wird in laufenden
Studien überprüft, inwieweit dieses System auch eine Rolle bei der
Regulation der uterinen Blutversorgung des Rindes spielt.
Um zu überprüfen, ob die transrektale Farbdopplersonographie der
A. uterina auch geeignet ist, um entzündungsbedingte Änderungen
in der uterinen Perfusion darzustellen,
wurde bei Kühen mittels intra-uteriner Infusion
von 100 ml einer 4%igen Lotagen®-
Lösung artifiziell eine Endometritis induziert.
Während es bei zwei Kontrolltieren,
denen 100 ml einer physiologischen Kochsalzlösung
infundiert wurden, zu keinen
Schwankungen in der uterinen Durchblutung
kam, wurde eine Stunde nach der
Infusion der Lotagen®-Lösung ein Anstieg
in der Blutflussgeschwindigkeit der A. ute-
rina um mehr als das 1,7fache ausgelöst
(Abb. 3). Sechs Stunden post infusionem
hatte die Blutflussgeschwindigkeit wieder
annähernd das Ausgangsniveau erreicht,
stieg dann aber zwischen den Stunden 6 und 48 wieder an. Am dritten
Tag post infusionem war die mittlere Blutflussgeschwindigkeit
wieder deutlich abgefallen, lag aber immer noch über den vor der
Infusion gemessenen Werten.
Luteale Durchblutung
Auch der luteale Blutfluss zeigte charakteristische Veränderungen
während des Zyklus (Abb. 4). Die Durchblutung, gemessen anhand
der Farbpixelzahl, stieg bis Tag 9 kontinuierlich an, blieb bis Tag 13
Abb. 4: Mittlere Blutflussgeschwindigkeit (time averaged maximum velocity =
TAMV) der A. uterina nach intrauteriner Infusion einer 4 %-igen Lotagen®- (n =
4 Kühe) bzw. physiologischen Kochsalzlösung (n = 2 Kühe). Darstellung der
Mittelwerte und Standardfehler (x ± s x ). * signifikanter Unterschied zur vorhergehenden
Untersuchung (p < 0,05).

Klinik für Rinder und Institut für Tierzucht der TiHo
Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Mariensee (FAL)
Zentrum für Frauenheilkunde und Zentrum für Anatomie der Georg-August-Universität Göttingen
auf ähnlichem Niveau und fiel ab Tag -5 stetig bis
Tag -1 ab. Die Korrelation zwischen lutealer
Durchblutung und den Plasmaprogesteronspiegeln
war höher als diejenige zwischen der Größe
des Corpus luteum und den peripheren Progesteronkonzentrationen.
Daraus lässt sich folgern,
dass die Farbdopplertechnik der B-Mode Sonographie
bei der Beurteilung des Funktionszustandes
des Corpus luteum überlegen ist.
In einer weiteren Studie wurden die Auswirkungen
einer medikamentös induzierten Luteolyse
auf die luteale Vaskularisation untersucht. Dazu
wurde Kühen zwischen den Tagen 8 und 10 post
ovulationem das PGF 2α -Analogon Tiaprost intramuskulär
appliziert und die Veränderungen in der
lutealen Blutversorgung, dem Durchmesser des
Corpus luteum sowie dem peripheren Progesteronspiegel
überprüft. Eine Stunde nach der Injektion
wurde überraschenderweise kein Abfall, sondern
ein Anstieg in der lutealen Durchblutung
festgestellt. Dieser Anstieg könnte auf entzündungsähnliche
Vorgänge, welche bei einer
Luteolyse eine wichtige Rolle spielen sollen,
zurückzuführen sein. Erst im weiteren Verlauf
kam es dann zum Abfall des lutealen Blutflusses,
der parallel mit dem Absinken der peripheren
Progesteronkonzentrationen einherging. Der
Rückgang im Durchmesser des Corpus luteum
war im Vergleich zu den Änderungen in der lutealen
Durchblutung und in den Progesteronkonzentrationen
nur relativ undeutlich ausgeprägt.
Schlussfolgerung und Ausblick
Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass die transrektale
Farbdopplersonographie ein geeignetes Verfahren darstellt, um
beim Rind auf nicht-invasivem Weg die genitale Durchblutung zu
messen. Mit Hilfe dieser Technik können im Bereich der Forschung
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Abb. 5: Luteale Durchblutung (gemessen an der Farbpixelzahl), Plasmaprogesteronkonzentration und
Durchmesser des Corpus luteum (x ± s x ) während des Zyklus der Kuh (n = 8); * signifikanter Unterschied
zur vorhergehenden Untersuchung (p < 0,05).
Abb. 6: Luteale Durchblutung (gemessen an der Farbpixelzahl), Plasmaprogesteronkonzentration und
Durchmesser des Corpus luteum (x ± s x ) nach Applikation von PGF 2α bei der Kuh (n = 8); * signifikanter
Unterschied zur vorhergehenden Untersuchung (p < 0,05).
wertvolle neue Erkenntnisse über die Physiologie und Pathophysiologie
des inneren Genitales beim weiblichen Rind gewonnen werden.
Daraus könnten sich neue Konzepte bei der Therapie von Fertilitätsstörungen
ergeben.
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Phytoöstrogene
Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik der TiHo
Institut für Tierernährung der TiHo
Klinik für kleine Klauentiere und Forensische Medizin und Ambulatorische Klinik der TiHo
Petra Winter, Alfonso Lampen, Tatjana Shobeiry, Dzmitry Karaljov, Charlotte Schröder, Karl-Heinz Waldmann, Heinz Nau,
Josef Kamphues
Untersuchungen zu östrogen-bedingten-Störungen der Fertilität
von Sauen mittels eines Reportergen-Assays
Zusammenfassung
Fruchtbarkeitsstörungen gehören zu den häufigsten Problemen
in der Nutztierhaltung und verursachen weltweit hohe
wirtschaftliche Verluste. Oft handelt es sich um ein multifaktorielles
Geschehen, bei dem mehrere Ursachen gleichzeitig vorliegen.
Im Zentrum vorliegender Untersuchungen stehen zurzeit
jene Fruchtbarkeitsstörungen, bei denen ein Zusammenhang mit
östrogen-aktiven Inhaltsstoffen in Futtermitteln vermutet wird
oder nachgewiesen ist. Beim Schwein werden Zearalenonkontaminationen
von Futtermitteln in allen Lehrbüchern der Nutztierreproduktion
als Ursache von Hyperöstrogenismus und verminderten
Konzeptionsraten genannt. Dabei konnte aber nur in
einem Teil der Proben, die wegen des Verdachts auf eine Mycotoxinkontamination
untersucht wurden, Zearalenon nachgewiesen
werden (Abb.1). Vor diesem Hintergrund stellt sich die Frage, ob
Phytoöstrogene für die Entwicklung des Hyperöstrogenismus
beim Schwein von Bedeutung sein können. Soja bzw. Sojanebenprodukte
(z.B. Sojaextraktionsschrot) als wichtige Proteinlieferanten
in der Schweinefütterung und gleichzeitig eine der
diätetischen Hauptquellen für Phytoöstrogene verdienen besonderes
Interesse. Zum einen wurden Futtermittel aus Betrieben
mit Hyperöstrogenismusproblemen mittels eines neuen Reportergen-Assays
auf ihre östrogene Aktivität hin analysiert. Zum
anderen wurde graviden Sauen phytoöstrogen-angereichertes
Futter verabreicht, um zu untersuchen, ob so bei neugeborenen
Ferkeln die besondere Form des Hyperöstrogenismus experimentell
ausgelöst werden kann.
Einige natürlich in Pflanzen vorkommende Substanzen zeigen
östrogenartige Wirkungen und werden allgemein als Phytoöstrogene
bezeichnet. Ihre Wirkung ist in der strukturellen Ähnlichkeit zum
17 ß-Estradiol, dem potentesten weiblichen Sexualhormon, begründet.
Anhand ihres chemischen Aufbaus lassen sich die Phytoöstrogene
in drei Hauptgruppen unterteilen: den Isoflavonen, den
Cumestanen, die jeweils zu den Flavonen gehören, und den Lignanen
als Nicht-Flavonoide. Die wichtigsten Vertreter der Isoflavone
sind Genistein, Daidzein und Glycitein. Sie werden fast ausschließlich
in Leguminosen gefunden. Eine besonders reichhaltige Quelle
dieser Phytoöstrogene ist die Sojabohne. Isoflavone sind in der
Pflanze glycosidisch gebunden, sind aber in dieser Form nicht
östrogen wirksam. Sie werden erst durch die Spaltung zu Aglyka
aktiv. Isoflavone werden durch die Bakterienflora im Magen-Darm-
Trakt deklycosidiert und in der Folge oxidiert. Die Isoflavone und
deren Metaboliten werden resorbiert und weisen per se östrogene
Effekte auf. Die Coumestane werden vor allem in verschiedenen
Kleearten, Luzerne und auch in geringerem Ausmaß in Sojaspros-
Summary
Fertility disorders are among the most common problems in animal
production and are responsible for high financial losses
worldwide. Such disorders are often due to a variety of factors
acting concomitantly. Research has concentrated on those fertility
disorders suspected of being caused by estrogenically active
substances in feedstuffs. The main reason cited in the literature
for hyperestrogenism in pigs is contamination of feedstuffs by the
mycotoxin zearalenone. Although there are many reports of
hyperestrogenism, zearalenone has been found in only a few
feed samples tested for mycotoxin contamination. Of particular
interest in this context is the influence of phytoestrogens on the
development of hyperestrogenism in pigs. There has been much
research on soy and soy products, which are preferred ingredients
in diets for pigs as a main source of proteins; but they are
also a main dietary source of phytoestrogens.
For the investigation of the relation between phytoestrogens and
hyperestrogenism, a reporter gene assay was used to analyze
feedstuffs from herds with hyperestrogenism problems. Furthermore,
pregnant sows were fed a diet enriched with phytoestrogens
to determine if the particular form of hyperestrogenism that
occurs in newborn piglets can be induced by phytoestrogens.
sen gefunden. Ihr wichtigster Vertreter ist Coumestrol. Lignane aus
Ölsaaten, Früchten und den äußeren Schichten von Getreidekörnern
sind selbst nicht östrogen aktiv. Sie werden erst von der Darmflora
durch Demethylierung zu den wirksameren Formen Enterolacton
und Enterodiol metabolisiert.
Abb. 1: Nachweishäufigkeit einer Kontamination mit Zearalenon in Futterproben
aus Sauenbeständen, die mit dem Vorbericht „Fruchtbarkeitsstörungen“ im
Jahre 2000 eingesandt wurden.

Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik der TiHo
Institut für Tierernährung der TiHo
Klinik für kleine Klauentiere und Forensische Medizin und Ambulatorische Klinik der TiHo
Die Mehrheit der Phytoöstrogene gehört zur Gruppe der Flavone
und kann bis zu 7 % der Trockenmasse einiger Pflanzen ausmachen.
Es gibt große Unterschiede zwischen den Konzentrationen
der Phytoöstrogene in den verschiedenen Pflanzen, aber auch
innerhalb einer Pflanzenart selbst. Die Konzentration der östrogenaktiven
Substanzen ist abhängig von Pflanzenspezies und -stamm,
aber auch von Faktoren wie Erntezeitpunkt, geographische Lage
des Pflanzenanbaus als auch von weiteren Umweltfaktoren wie z.B.
der Wasserversorgung oder ein möglicher Pilzbefall.
Östrogene Wirkungen
Östrogenvermittelte biologische Reaktionen erfordern die Bindung
des Hormons an den Estrogenrezeptor (ER). Dieser gehört zur großen
Familie der nukleären Steroid-Rezeptoren. Die Strukturanalogie
der Phytoöstrogene zum 17 ß-Estradiol bedingt die Affinität zum
Estrogenrezeptor (Abb. 2). Durch die Bindung eines Liganden an
den Estrogenrezeptor kommt es zur Konformationsänderung des
Hormon-Rezeptor-Komplexes und Bildung eines Homodimers aus
zwei Hormon-Rezeptor-Komplexen. Diese lagern sich an die Estrogen-Response-Elements
(ERE) auf der DNA an und aktivieren so
die Transkription östrogen gesteuerter Gene.
Abb. 2: Strukturähnlichkeit der Phytoöstrogene vom Isoflavon-Typ zum Estradiol
Es sind zwei Hauptisoformen des Estrogenrezeptors identifiziert: ER
alpha und ER beta. Die Expression beider Rezeptoren in den Geweben
ist unterschiedlich. Während der ER alpha vor allem in den
Brustdrüsen, den Zellen der Vagina, dem Endometrium, im Ovar und
im Hypothalamus stark verbreitet ist, kommt der ER beta vor allem
in den Ovarien, im Hypothalamus, dem Knochengewebe, im Herz-
Kreislaufsystem, in den männlichen Geschlechtsorganen und in der
Großhirnrinde vor. Die Rezeptoren besitzen jeweils fünf unterschiedliche
Domänen, jede von ihnen mit einer anderen Funktion. Die
wichtigsten Domänen sind die DNA-Bindungsdomäne (mit zwei
Zinkfingern für die spezifische Bindung an die DNA) und die Liganden-Bindungsdomäne
(direkte Interaktion von Aminosäuren der
Liganden-Bindungsdomäne mit dem Östrogenmolekül). Die Stärke
dieser Interaktion steht in direkter Korrelation zur Affinität zum Estrogenrezeptor.
Das 17 ß-Estradiol besetzt die Liganden-Bindungsstelle
zu einem großen Teil und zeigt daher eine sehr hohe Affinität.
Phytoöstrogene besitzen Hydroxylgruppen und Phenolgruppen, die
eine ähnliche Raumanordnung wie die des 17 ß-Estradiols einnehmen
(Abb.2) und binden ebenfalls an den Estrogenrezeptor, jedoch
mit geringerer Affinität. Im Gegensatz zum 17 ß-Estradiol besitzen
Phytoöstrogene und insbesondere Isoflavone außerdem eine deutlich
höhere Affinität zum ER beta als zum ER alpha und können
daher als SERMs (Selective Estrogen Receptor Modulator) bezeichnet
werden. Die relative Bioaktivität von Phytoöstrogenen – gemessen
mittels eines Bioassays mit humaner Zellkultur – ist im Vergleich
zum 17 ß-Estradiol relativ gering: 17 ß-Estradiol 100 (Zearalenon 1),
Coumestrol 0,202 , Genistein 0,084 und Daidzein 0,013 .
Funktionelle Analytik: Reportergen-Assay
Die große Vielfalt von Substanzen mit einer Affinität zum Estrogenrezeptor
macht eine Voraussage des östrogenen Potentials eines Substanzgemisches
schwierig, wenn nicht gar unmöglich. Mit konventionellen
analytischen Methoden wie der GC-MS oder LC-MS lassen
sich zwar die Inhaltsstoffe einer Probe sehr gut ermitteln, es können
jedoch keine Aussagen zur Wirksamkeit der gefundenen Substanzen
getroffen werden, sofern nicht detaillierte pharmakologische oder
toxikologische Daten vorliegen. Analytische Systeme zur Erfassung
von Östrogenen bzw. östrogen-aktiven Stoffen sollten daher die
potenzielle Wirkung eines Stoffes oder Stoffgemisches erfassen.
Ein schnelles In-vitro-Screeningsystem zur Durchmusterung einer
großen Anzahl unterschiedlicher Stoffklassen auf ihr hormonelles
Potential ist ein Reportergen-Assay auf der Basis von Human
Embryonic Kidney 293 Zellen (Hek 293 Zellen). Reportergene kodieren
für Proteine, die leicht quantifizierbar sind und zugleich von
endogenen Proteinen gut unterschieden werden können. In diesem
Fall wurden die Hek 293 Zellen stabil (mit dauerhaftem Einbau des
Reportergens in das Wirtszellgenom) mit dem Luciferase-Reportergen,
dem Response Element und den entsprechenden Rezeptorgenen
für ER alpha und beta transfiziert. Die Zellen exprimieren jeweils
den ER alpha oder den ER beta. Nach Bindung eines Liganden an
den Rezeptor ändert dieser seine Konformation, bindet im Zellkern
an das Estrogen-Response-Element der DNA und aktiviert so die
Transkription des vom Response-Element kontrollierten Luciferase-
Reportergens. Zur Quantifizierung der gebildeten Luciferase werden
Abb. 3: Funktionelles Prinzip des Reportergen-Assays. Messung der Luciferase-Aktivität.
RE = Response Element.
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44
Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik der TiHo
Institut für Tierernährung der TiHo
Klinik für kleine Klauentiere und Forensische Medizin und Ambulatorische Klinik der TiHo
Abb. 4 : Mittlere Gehalte an alpha-aktiven und beta-aktiven Estradiol-Equivalenten
in μg EEQ / kg Futter in Proben aus Beständen mit (n=14) und ohne Hyperöstrogenismus
(n=14)
die Zellen lysiert, danach erfolgt die Messung der Lichtblitze, die bei
der Umsetzung von zugesetztem Luciferin durch die Luciferase
gebildet werden (Abb. 3).
Zielsetzung
Ziel der Untersuchungen war zunächst, in einem gemeinsamen Projekt
des Instituts für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik,
des Instituts für Tierernährung und der Klinik für kleine Klauentiere
mit dem Reportergen-Assay eine geeignete funktionelle Methode
zu etablieren, mit der ein Nachweis östrogen-aktiver Substanzen
gelingt. Somit können Proben genauer untersucht werden, die im
Zusammenhang mit dem Auftreten von Hyperöstrogenismus stehen,
jedoch keine bzw. keine erhöhten Gehalte an Zearalenon aufweisen.
In einem weiteren Schritt wurden die Phytoöstrogene aus Soja, die
aufgrund ihrer östrogenen Aktivität eventuell Ursache für das Auftreten
des Hyperöstrogenismus sind, konzentriert im Futter gravider
Sauen (eine Woche vor der Geburt) eingesetzt, um experimentell
das Bild des Hyperöstrogenismus bei neugeborenen Ferkeln auszulösen.
Ergebnisse
Untersuchungen von Futtermitteln aus Betrieben mit
und ohne Hyperöstrogenismusproblematik
Es wurden Mischfutterproben aus Betrieben, in denen wiederholt
Tiere hyperöstrogene Effekte zeigten und zugleich Proben aus
Betrieben ohne derartige Störungen mittels des dargestellten
Reportergen-Assays untersucht. Die Vorbehandlung der Futterproben
erfolgte durch eine Flüssig-Flüssig-Extraktion. Die molaren Estradiol-Dosisequivalente
(EEQ) der untersuchten Proben in der Zellkultur
wurden durch mathematische Ableitung aus Funktionsgleichungen
von 17 ß-Estradiolstandardkurven ermittelt und auf μg
EEQ pro Kilogramm Probe umgerechnet. Die mittleren Gehalte der
Estradiol-Equivalente in Futterproben aus Betrieben mit Hyperöstrogenismussymptomen
waren doppelt so hoch wie in Futterproben
aus nicht betroffenen Tierbeständen. Es zeigte sich jedoch ein sehr
inhomogenes Bild in der Verteilung der EEQ-Gehalte, so dass kein
signifikanter Unterschied zwischen Proben aus Betrieben mit
Hyperöstrogenismus und ohne Hyperöstrogenismus besteht. Eine
parallel vorgenommene Untersuchung der Futterproben auf Zearalenon
zeigte nur eine geringe Beteiligung an dem Gesamtgehalt
östrogener Aktivität bzw. es wurde in vielen Fällen trotz hoher EEQ-
Gehalte kein Zearalenon nachgewiesen.
Untersuchungen zur möglichen Auslösung des Hyperöstrogenismus
bei neugeborenen Ferkeln durch experimentell
phytoöstrogen-angereichertes Futter
Die östrogen-aktiven Phytohormone des Sojas wurden konzentriert
in ein Mischfutter für laktierende Sauen eingemischt (10 g Isoflavongemisch
pro Tier und Tag, d.h. im Durchschnitt 43 mg Isoflavone /
kg KM). Nach Feststellung erhöhter östrogener Aktivität des Futters
im Vergleich zu einem Kontrollfutter mittels des Reportergen-
Assays wurde es über eine Woche ante partum an gravide Sauen
verabreicht, um so eventuell das klinische Bild des Hyperöstrogenismus
bei neugeborenen Ferkeln zu provozieren. Die Ferkel zeigten
unmittelbar nach der Geburt klinisch aber nur bedingt und
ansatzweise das „typische Bild“ des Hyperöstrogenismus. Bisherige
Untersuchungen des Kolostrums der Muttersauen lassen nicht
auf eine erhöhte östrogene Aktivität schließen, so dass die Exposition
der Ferkel über das Kolostrum von Sauen, die kurz vor der
Geburt sehr hohe Aufnahmen an Phytoöstrogenen hatten, in Frage
steht.
Ausblick
Das Kolostrum von Sauen, die ein phytoöstrogen-angereichertes
Futter erhielten, scheint bei Ferkeln mit hyperöstrogenen Effekten
nicht der ausschlaggebende Faktor zu sein. Vielmehr ist zu prüfen,
ob der intrauterinen Exposition eine größere Bedeutung zukommt.
Des Weiteren sind auch kritische Expositionszeitpunkte in der Entwicklung
des Ferkels zu berücksichtigen; wirkt sich die Phytoöstrogenbelastung
auf die Ferkel nicht zum Zeitpunkt der Geburt aus, so
kann es dennoch – entsprechenden experimentellen Untersuchungen
an kleinen Labortieren zufolge – zu Entwicklungsstörungen zu
einem späteren Zeitpunkt wie etwa in der Pubertät kommen.

Einleitung
Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Mariensee (FAL),
Forschungsbereich Biotechnologie
Christine Wrenzycki, Andrea Lucas-Hahn und Heiner Niemann
Assistierte Reproduktionstechniken und Epigenetik:
Die neue Flexibilität in der Embryonalentwicklung
Zusammenfassung
Die Produktion von Rinderembryonen im Reagenzglas (In-vitro-
Produktion, IVP) wurde in den letzten Jahren bis zur Praxisreife
entwickelt und stellt mittlerweile eine gute Ergänzung zu konventionellen
reproduktionsmedizinischen Techniken wie der Superovulationstechnik
und Embryonenspülungen dar. Allerdings können
Embryonen und Kälber, je nach dem, ob sie mit der IVP-
Technik produziert oder in vivo gewonnen wurden, Unterschiede
aufweisen. Abnormalitäten, die bei den in vitro produzierten
Tieren auftreten können, werden als „Large offspring syndrome
(LOS)“ zusammengefasst. Die Ursachen für dieses Phänomen,
das auch nach dem Transfer geklonter Embryonen auftreten
kann, sind noch weitgehend unbekannt. Es wird vermutet, dass
Störungen in der Expression entwicklungsrelevanter Gene bedingt
durch Änderungen der epigenetischen Modifikationen, z.B.
DNA-Methylierung und Histon-Modifikationen, während der
frühen Embryonalentwicklung eine wichtige Rolle spielen.
Seit der Geburt des ersten Kalbes, das aus dem Transfer eines IVP-
Embryos entstanden ist, hat die Technologie enorme Fortschritte
erfahren und wird bereits vielfach in der Praxis angewendet. Die Invitro-Produktion
von Embryonen wird heute häufig in Kombination
mit weiteren biotechnischen Methoden eingesetzt, wie z.B. der
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Summary
In vitro production (IVP) of embryos has significantly been
improved in cattle and can be used as an alternative to conventional
MOET programs. However, the quality of IVP embryos is
impaired in comparison with their in vivo counterparts, and a considerable
proportion of the embryos is afflicted by the “large offspring
syndrome (LOS)“ which is also seen after transfer of
embryos derived from somatic nuclear transfer (sNT). The exact
mechanism(s) by which IVP and sNT proceed are not yet known.
It is thought that altered expression patterns of developmentally
important genes due to abnormal epigenetic modifications, i.e.
DNA methylation and histone modifications, are responsible for
the induction of LOS.
Eizellgewinnung vom lebenden Tier durch transvaginale Follikelpunktion
(Ovum pick up, OPU) und dem Klonen mit Hilfe des somatischen
Kerntransfers (somatic nuclear transfer, sNT). Der Anteil an
IVP-Kälbern hat sich insbesondere nach der Praxiseinführung der
transvaginalen Follikelpunktion deutlich erhöht. Die Anzahl lebender
Nachkommen aus dem somatischen Kerntransfer ist dagegen
noch begrenzt, obwohl die Forschungsaktivitäten auf dem Gebiet
des somatischen Klonens von Nutztieren nach der Geburt von
„Dolly“, dem ersten Klonschaf, stark zugenommen haben. Die
Anwendungsperspektiven für das Klonen in der Forschung, der Biomedizin
und der praktischen Tierzucht sind sehr viel versprechend.
ein optimales Darmklima, mehr Appetit, bessere Futter -
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46
Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Mariensee (FAL),
Forschungsbereich Biotechnologie
In-vitro-Produktion von Rinderembryonen
und somatisches Klonen: Erfolgsquoten
Die IVP setzt sich im Wesentlichen aus drei methodischen
Schritten zusammen:
In-vitro-Reifung (in vitro maturation, IVM) der Eizellen
In-vitro-Befruchtung (in vitro fertilization, IVF) der
gereiften Eizellen
In-vitro-Kultur (in vitro culture, IVC) der befruchteten
Eizellen bis zum transfertauglichen Embryonalstadium
(Morula, Blastozyste)
Heute können bereits durchschnittliche Erfolgsraten von
85-95% bei der In-vitro-Reifung, 80-90% bei der In-vitro-
Befruchtung und 25-40% bei der Entwicklung bis zur
Blastozyste erzielt werden, so dass bei einer Trächtigkeitsrate
von durchschnittlich 50% 12-15 Kälber nach
dem Transfer von IVP-Embryonen geboren werden können (Abb. 1).
Körperzellen von Feten oder erwachsenen Tieren, die über längere
Zeit in vitro kultiviert wurden, können erfolgreich im somatischen
Kerntransfer eingesetzt werden. Die Effizienz der einzelnen Schritte
beträgt beim Rind 95-100% für die Enukleation (Entfernen des
genomischen Materials der Eizelle), für die Fusion der enukleierten
Eizelle mit der Spenderzelle 80-90% und für die Aktivierung 90-95%.
Durchschnittlich 20-30% der produzierten Embryonen entwickeln sich
bis zur Blastozyste. Ist der Transfer des Embryos gelungen, werden
10-15% lebende Nachkommen geboren (Abb. 1).
Phänomen der übergroßen Kälber (LOS)
Trotz der vielen Verbesserungen, die die IVP in den letzten Jahren
erfahren hat, unterscheiden sich in vitro produzierte Embryonen
nach wie vor in zahlreichen Details von in vivo gewonnenen
Embryonen. Unterschiede wurden hinsichtlich der Morphologie, der
Entwicklungsgeschwindigkeit, der Gefriertauglichkeit, metabolischer
Parameter sowie im Genexpressionsmuster beschrieben.
Unterschiede bestehen auch bei aus IVP- und sNT-Embryonen
resultierenden Kälbern im Vergleich zu konventionell erzeugten. Sie
werden unter dem Begriff „Phänomen der übergroßen Kälber
(Large offspring syndrome, LOS)“ zusammengefasst. Neben der
charakteristischen Übergröße treten Abweichungen in Form von
erhöhten pränatalen Verlusten, Schwergeburten, verlängerten
Trächtigkeiten, Atemproblemen, Saugschwierigkeiten sowie plötzlichem
perinatalen Tod auf. Die Kälber weisen außerdem häufiger
einen veränderten Energiestoffwechsel auf. Weiterhin sind Abnormalitäten
in verschiedenen Organen beschrieben worden, z.B.
erhöhte Muskelmasse, Veränderungen in der Zusammensetzung
der Muskelfasern, zerebelläre Dysplasie sowie Missbildungen des
Skeletts. Oft wird auch von Veränderungen der Plazenta, wie z.B.
Eihautwassersucht, berichtet. Trotz des Übergewichtes und der teilweise
erheblichen Übergröße zum Zeitpunkt der Geburt, hat sich
gezeigt, dass nach 8-12 Monaten diese Unterschiede im Vergleich
zu Kontrolltieren nicht mehr vorhanden sind. Abnormal große Herzen
können zu diesem Zeitpunkt allerdings noch auftreten.
Die ursächlichen Mechanismen sind noch weitgehend unbekannt.
Es wird vermutet, dass Fehler in der Regulation embryonaler und
Abb. 1: In-vitro-Produktion und somatisches Klonen beim Rind
fetaler Gene bei der Ausbildung dieses komplexen Phänomens eine
Rolle spielen. Die in der Humanmedizin auftretenden Erkrankungen,
Beckwith-Wiedemann-Syndrom (BWS) und Angelman-Syndrom
(AS), weisen große Ähnlichkeiten zu LOS auf. Es wird vermutet,
dass die Erkrankungen im Zusammenhang mit der künstlichen
Befruchtung auftreten.
Expression entwicklungsrelevanter Gene während
der frühen Embryonalphase
Für die reguläre Entwicklung des Embryos vor dem Einsetzen in die
Gebärmutter ist es wichtig, dass die Expression der entwicklungsrelevanten
Gene genau abgestimmt ist. Die frühe Entwicklungsphase
ist von Genprodukten abhängig, die bereits während der Eireifung
synthetisiert wurden (maternales Genom). Die späteren Stadien
sind auf embryonale Genprodukte angewiesen. Die Aktivierung
des embryonalen Genoms erfolgt in zwei Schritten: der ersten
frühen Aktivierung und der danach folgenden Hauptaktivierung.
Beim Rind findet der Übergang der Kontrolle vom maternalen zum
embryonalen Genom (maternal-embryonic transition, MET) im 8-
16-Zellstadium statt (Abb. 2). Somit können die einzelnen Transkripte
unterschiedliche Expressionsmuster aufweisen. Sie sind in
Abbildung 3 dargestellt. Abweichungen von diesem Ablauf sind
möglicherweise die Ursachen für das LOS.
Molekulare Ursachen für LOS
Der Begriff Epigenetik bezeichnet alle Veränderungen im Genom,
denen keine Veränderung der DNA-Sequenz selbst zugrunde liegt.
Bei Säugetieren spielen die DNA-Methylierung und die Modifikationen
der Histone eine zentrale Rolle in der Epigenetik. Sie sind an
wichtigen Entwicklungsvorgängen, wie dem genomischen Imprinting
und der Inaktivierung des X-Chromosoms beteiligt. Das genomische
Imprinting kann man vereinfacht als elternspezifische Ausprägung
einer genetischen Anlage bezeichnen. Durch das Anhängen
einer Methylgruppe werden die mütterlichen und väterlichen
Gene entweder aktiviert oder abgeschaltet. Durch die Methylierung
wird folglich geregelt, ob die mütterlichen oder die väterlichen Gene
abgelesen werden. Die X-Chromosom-Inaktivierung tritt nur bei
weiblichen Tieren auf. Im Laufe der Embryogenese wird eins der

Abb. 2: Maternale und embryonale Genexpression bei Rinderembryonen.
Abb. 3: Mögliche Transkriptionsverläufe während der präimplantatorischen Entwicklung
von Rinderembryonen.
beiden X-Chromosomen inaktiviert. Auch die X-Chromosom-Inaktivierung
wird durch die Methylierung der DNA wesentlich beeinflusst.
Nicht so einheitlich in ihren Wirkungen auf die Genexpression
sind die unterschiedlichen Veränderungen von Histonen. Eine
Acetylierung der Histone führt meistens zur Aktivierung der Transkription,
also dem Ablesen eines Gens. Bei der Methylierung von
Histonen entscheidet die Position der Methylgruppe, ob die Transkription
aktiviert oder gehemmt wird.
Epigenetische Modifikationen wie DNA-Methylierungen und Histon-
Modifikationen werden als mögliche Ursache des LOS diskutiert.
Die DNA-Methylierungen des gesamten väterlichen und mütterlichen
Genoms werden in zwei Entwicklungsphasen komplett gelöscht.
Diese Demethylierungen finden einmal vor und einmal nach
der Befruchtung statt. Die erste Phase findet in den Keimzellen beider
Geschlechter statt und führt zu einer raschen Demethylierung
des gesamten Genoms, bevor die neue Methylierung in den männlichen
und weiblichen Keimzellen einsetzt. Die zweite Demethylierung
wird nach der Befruchtung beobachtet. Zunächst erfolgt direkt
nach der Befruchtung die schnelle aktive Demethylierung des väterlichen
Genoms. Das mütterliche Genom unterliegt einer passiven
Demethylierung während der sich anschließenden Teilungen.
Einige dauerhaft elterlich geprägte (imprinted) Gene sind hiervon
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48
ausgenommen. Sie behalten ihre keimbahnspezifischen Methylierungsmuster
bei. Die De-novo-Methylierung beginnt beim Rinderembryo
im 8-16-Zellstadium. Also genau dem Zeitpunkt, zu dem die
genetische Kontrolle des Embryos vom maternalen auf das
embryonale Genom übergeht.
Die Blastozyste besteht aus den Zellen der inneren Zellmasse (ICM)
und des Trophektoderms (TE). Die DNA der Zellen der inneren Zellmasse
der Blastozyste zeigt normalerweise eine besonders starke
Methylierung (Hypermethylierung), während die DNA der Trophektodermzellen
weniger methyliert ist (Hypomethylierung). Es konnte
gezeigt werden, dass die DNA geklonter Blastozysten in allen Zellen
eine Hypermethylierung aufweist (Abb. 4). Die DNA in den Zellen
des Trophektoderms enthält also erheblich mehr Methylierungen als
üblicherweise. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass die
Mengen der Transkripte der Enzyme, die die Methylgruppen an die
DNA anlagern (DNA-Methyltransferasen) durch die In-vitro-Produktion
und/oder dem somatischen Kerntransfer (sNT) beeinflusst werden.
Über das genomische Imprinting beim Rind ist bisher wenig bekannt.
Ein Gen, das dem Imprinting unterliegt, wird nur von einem der elterlichen
Allele exprimiert. Ist es maternal „imprinted“, wird es vom
väterlichen Allel exprimiert und umgekehrt. Bei Maus und Mensch
sind mehr als 80 Gene bekannt, die dem Imprinting unterliegen.
Durch intensive Forschungsaktivitäten in jüngster Vergangenheit
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Abb. 4: Rückprogrammierung der DNA-Methylierung in präimplantatorischen
Rinderembryonen
sind mittlerweile sechs bovine Gene identifiziert, die abhängig von
ihrer elterlichen Herkunft exprimiert werden. Die Untersuchungen
sind an fetalem oder adultem Gewebe geklonter Tiere durchgeführt
worden. Ergebnisse für Embryonen liegen noch nicht vor.
Untersuchungen auf mögliche Störungen der epigenetischen Rückprogrammierung
und der damit in Verbindung stehenden Phänomene
sind somit viel versprechend, um die zugrunde liegenden
Mechanismen von Entwicklungsabnormalitäten (u. a. LOS) zu verstehen.
Das Rind könnte aufgrund seiner ähnlichen frühen Embryonalentwicklung
auch für den Menschen ein wichtiges Modell darstellen.
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Versuchstier: Der Goldbaumsteigerfrosch
Der Goldbaumsteigerfrosch, Dendrobates auratus (CITES Appendix
II), ist ein ca. 3,5 - 4,5 cm langer und nur etwa 3 g schwerer Vertreter
der Gattung Dendrobates innerhalb der Familie der Dendro-
Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
Christian Lipke, Sabine Meinecke-Tillmann, Burkhard Meinecke
Assistierte Reproduktion bei Baumsteigerfröschen:
Ein veterinärmedizinischer Beitrag zur Erhaltung
gefährdeter Tierarten
Zusammenfassung
Die Geschichte des Frosches als Modelltier in der modernen Wissenschaft
reicht bis in das 19. Jahrhundert und davor zurück. Er
ist auch heute nicht aus den Forschungslaboratorien wegzudenken.
Seit einigen Jahrzehnten allerdings ist ein erschreckender
weltweiter Rückgang der Amphibienpopulationen zu
beobachten, dessen Ursachen vor allem für die Frösche in Südund
Mittelamerika nur unvollständig geklärt sind. So rücken die
Frösche nun um ihrer selbst willen in den Fokus der Wissenschaft,
um eine drohende Ausrottung dieser faszinierenden
Tiere zu verhindern. Dabei wächst das Interesse an der
Fortpflanzungsphysiologie dieser Tierarten, mit dem Ziel, in der
Zukunft Gametenbanken anzulegen.
In diesem Artikel soll neben der Laborhaltung gefährdeter tropischer
Frösche, welche als Grundvoraussetzung für alle weiteren
Arbeiten anzusehen ist, die Technik der Spermiengewinnung
vom lebenden Frosch sowie die Morphologie und Morphometrie
gewonnener Spermien am Beispiel des Goldbaumsteigers,
Dendrobates auratus, als ein wichtiger Beitrag zur
Erhaltung gefährdeter Tierarten beschrieben werden.
Abb. 1: Der Goldbaumsteigerfrosch, Dendrobates auratus (Variante aus Costa
Rica)
Summary
The history of frogs as laboratory animals in modern research
began in the 19th century and even earlier, and frogs still play an
important role in many laboratories. However, in recent decades
there has been a worldwide and alarming decline in amphibian
populations. The reasons for such losses in South and Central
American frog populations in particular are still unknown.
Thus the frogs themselves have now become the focus of scientific
research to prevent the extinction of these fascinating animals.
Of particular interest is their physiology and the establishment
of gamete banks in the future.
In addition to outlining the basic requirements for laboratory care
and maintenance of endangered tropical frogs, this article also
describes the method of induced spermiation and presents the
morphology and morphometry of the spermatozoa of the Green
Poison-Dart Frog, Dendrobates auratus, as an important contribution
to the conservation of endangered species.
batidae (Baumsteigerfrösche), dessen natürliches Verbreitungsgebiet
sich vom Norden Kolumbiens, über Panama und Costa Rica,
bis hin zum südlichen Nicaragua erstreckt (Abb. 1 u. 2). Zwei weitere
Populationen sind auf Tobago und Oahu (Hawaii) beheimatet.
Die tagaktiven Frösche bewohnen dort den bodennahen Wurzelbereich
sowie die Laubschicht der tropischen Regenwälder.
Abb. 2: Dendrobates auratus mit der Grundfarbe Bronze aus Panama
49

50
Die Grundfarbe der Haut ist meist schwarz, kann aber bei einigen
Populationen auch bräunlich oder bronzefarben sein und wird stets
von dunkel- bis hellgrünen, blaugrünen oder sogar weißen bis gräulichen
Flecken oder Bändern durchzogen. In einigen Populationen
kann die schwarze Grundfarbe die grüne Bänderung fast völlig verdrängen.
Als ein sicheres äußeres Unterscheidungsmerkmal der Geschlechter
gilt die Breite der Haftscheibe des dritten vorderen Fingers, welche
beim männlichen Frosch relativ zur Körperlänge größer ausfällt
als beim Weibchen. Ein schmaler Körperbau hingegen kann lediglich
auf ein männliches Tier hinweisen.
Reproduktionsverhalten
Die männlichen Goldbaumsteigerfrösche verteidigen ihr festes
Revier gegenüber anderen männlichen Eindringlingen, indem ständig
wechselnde Rufplätze aufgesucht werden, von denen aus der
Frosch einen schnarrenden Laut abgibt. Revierkämpfe zwischen
zwei Männchen werden durch Schieben und Klammern der Gegner
ausgetragen.
Die Frösche sind ganzjährig fortpflanzungsfähig, allerdings wird die
Fortpflanzungsbereitschaft durch klimatische Veränderungen wie
Temperatur- oder Luftdruckschwankungen sowie durch höhere
Luftfeuchte nach längeren Trockenphasen deutlich stimuliert.
Ein herausragendes Merkmal von Dendrobates auratus sowie aller
Baumsteigerfrösche stellt sowohl ein komplexes Paarungsverhalten
als auch ein mehr oder weniger stark ausgeprägtes Brutpflegeverhalten
dar, was für Vertreter der Amphibien eine Besonderheit bedeutet.
Betritt ein Weibchen das Revier, erfolgt eine erste Kontaktaufnahme
in Form von gegenseitigen Kopfberührungen. Im weiteren Verlauf
folgt das Weibchen visuell orientiert dem Männchen, bis ein geeigneter
Ablaichplatz erreicht ist. Dabei kann ein recht weiter Weg von
etwa 5 - 6 Metern in einer Zeit von 2 Stunden zurückgelegt werden.
Sollte das Weibchen zurückbleiben, so wird es durch Berührungen
des Partners zum Folgen aufgefordert. Am Ablaichort angekommen,
übernimmt der weibliche Frosch die aktive Stimulation des
Partners, indem der Rücken des Männchens bestiegen oder durch
trommelnde Bewegungen mit den Hinterbeinen berührt wird. Darüber
hinaus wird das Männchen wiederholt umrundet und mit Kopfberührungen
fortwährend stimuliert. Nach der Ablage von 5 - 10
Eiern auf einer glatten Fläche, z.B. einem Blatt, und der Befruchtung,
trennen sich die Wege der beiden Geschlechtspartner wieder.
Das anschließende Brutpflegeverhalten wird bei Dendrobates auratus,
anders als bei anderen Baumsteigerfröschen, ausschließlich
vom Männchen gezeigt. Kurze Zeit nach der Befruchtung kehrt es
zurück und bewässert das Gelege, indem es sich direkt auf dieses
setzt. Durch diese Prozedur wird eine Quellung der die eigentlichen
Eier umgebenden Eigallerte gewährleistet. Nach etwa 14 Tagen
sind die Kaulquappen ausreichend entwickelt, um aus den Gallerten
zu schlüpfen. Dabei können sie von dem Männchen unterstützt
werden, welches in regelmäßigen Zeitabständen das Gelege aufsucht.
Indem es sich auf das Gelege setzt, wird zusätzlicher Druck
von außen auf die Gallerthüllen ausgeübt, um den Schlupf ggf. zu
beschleunigen. Jeweils 1 - 3 Quappen schlängeln sich auf den
Rücken des männlichen Frosches und werden so zu einer geeigneten
Wasseransammlung (z.B. Bromelientrichter) getragen, wo sie
sich eigenständig entwickeln.
Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
Laborhaltung
Sollen exotische Amphibien im Labor gehalten werden, sind vielfältige
Voraussetzungen und Besonderheiten zu beachten. Die Tiere
werden in Kleingruppen in Glasterrarien bei einer Umgebungstemperatur
von 25 - 28 °C, einer relativen Luftfeuchte von ca. 85 - 95%
und einem Lichtrhythmus von 12:12 Stunden gehalten (Abb. 3). Der
Bodengrund besteht aus strukturiertem braunen Acrylglas, da dieses,
anders als der häufig verwendete feine Blähton, problemlos zu
reinigen ist. Darüber hinaus ist so die Gefahr des Verschluckens
von Bestandteilen dieses Granulates und eines daraus folgenden
tödlichen Darmverschlusses beseitigt. Die Seitenwände sind mit
Baumfarnplatten ausgekleidet, die einerseits durch ihre Fähigkeit
Wasser zu speichern, das Klima im Terrarium positiv beeinflussen
und andererseits den Fröschen eine Struktur zum Klettern bieten.
Die Fütterung erfolgt mit lebenden Fruchtfliegen, die vorher mit Vitaminpulver
bestäubt werden.
Abb. 3: Glas-Terrarium für vier Tiere (Acrylglas-Bodengrund mit Gefälle)
Spermiengewinnung am lebenden Frosch
Da eine Spermiengewinnung nach Tötung der Tiere und anschließender
Isolierung der Hoden, wie es bei Laborfröschen gängige
Praxis ist, bei gefährdeten Tierarten nicht in Betracht gezogen werden
sollte, wird im vorliegenden Fall die Abgabe der Spermien
durch hormonelle Beeinflussung induziert.
Die für alle nachfolgenden Manipulationen essentielle sichere Fixierung
der Goldbaumsteigerfrösche wird gewährleistet, indem der
Frosch in ein mit Wasser angefeuchtetes Gazegewebe eingehüllt
wird, welches Abwehrbewegungen weitestgehend unterbindet. Hingewiesen
werden soll an dieser Stelle noch einmal auf die geringe
Größe (3,5 - 4,5 cm) und das geringe Gewicht (ca. 3 g) von Dendrobates
auratus. Diese Gegebenheiten erfordern sowohl in Hinblick
auf die Entwicklung der Methoden als auch auf deren manuelle
Ausführung höchste Präzision und Sorgfalt, damit die Tiere keinen
Schaden erleiden.
Die sicher fixierten männlichen Frösche erhalten eine Injektion von
humanem Choriongonadotropin (hCG) in den dorsalen Lymphsack,
um die Spermiation (Abgabe der Spermien) auszulösen (Abb. 4).

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52
Abb. 4: Applikation von hCG in den dorsalen Lymphsack des sicher fixierten
Frosches
Dafür muss zuerst die äußerst derbe und verschiebliche äußere
Haut durchdrungen werden, um das darunter gelegene Lymphsystem
zu erreichen. Dieses System von Lymphräumen erstreckt sich
über weite Teile des Froschkörpers und stellt einen geeigneten
Zugang für Injektionen dar. Die Spermien werden durch Kloakenspülungen
mit Hilfe einer kleinen Knopfkanüle zu verschiedenen
Zeitpunkten gewonnen (Abb. 5). Bereits 15 Minuten nach Applikation
von hCG kann eine Abgabe von Spermien nachgewiesen werden.
30 Minuten nach hCG-Gabe ist die Spermienabgabe am
höchsten, während nach 120 Minuten keine Spermatozoen mehr
aus der Kloake gewonnen werden können.
Abb. 5: Spülung der Kloake (Öffnung als V-förmiger Wulst erkennbar) mit Hilfe
einer feinen Knopfkanüle zur Gewinnung der abgegebenen Spermien
Die Spermien
Die Spermien von Dendrobates auratus bestehen aus einem sichelförmig
gekrümmten Kopfstück und einem Spermienschwanz. In der
Biegung des hinteren Kopfbereiches befindet sich bei ca. 64 % der
Spermatozoen eine inhomogene, zellähnliche Struktur, bei der es
sich um eine akzessorische Zelle handeln könnte. Ein Mittelstück ist
nur bei ca. 15 % der Spermien erkennbar, eine undulierende Membran
fehlt stets.
Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
Die festgestellte durchschnittliche Gesamtlänge der Spermien
beträgt ca. 56 μm. Die Länge des Kopfes wird mit etwa 21 μm
gemessen, während der Schwanz eine Länge von etwa 35 μm aufweist.
Der Durchmesser der Kopfmitte beträgt ca. 2 μm. Darüber
hinaus kann sowohl der Umfang als auch der Flächeninhalt des
Kopfstückes in der zweidimensionalen Ansicht bestimmt werden.
Der Umfang beträgt etwa 44 μm, die Fläche des Kopfstückes wird
mit ca. 36 μm 2 bestimmt (Abb. 6). Das Verhältnis von Kopf- zu
Schwanzlänge beträgt 1 zu 1,7.
Abb. 6: Spermium von Dendrobates auratus, Vermessung des Schwanzes mit
der segmentierten Messmethode (800x, Phasenkontrastmikroskop)
Weitere Vorhaben
Um die Ultrastruktur der Spermatozoen näher charakterisieren zu
können, wird zurzeit an Methoden gearbeitet, mit denen diese
geringen Spermienmengen für die in der Elektronenmikroskopie
notwendigen umfangreichen Fixierungs- und Färbeschritte vorbereitet
werden können. Eine induzierte Abgabe von Eiern bei weiblichen
Tieren ist nach gleicher Vorgehensweise erfolgreich durchgeführt
worden. Die Struktur dieser Eier wird ebenfalls licht- und elektronenmikroskopisch
näher untersucht.
Ein weiterer wichtiger Schritt wird die Erarbeitung von Methoden zur
Kryokonservierung befruchtungsfähiger Gameten des Goldbaumsteigerfrosches
sein.
Mit diesen Arbeiten soll gezeigt werden, dass einerseits etablierte
reproduktionsmedizinische Techniken auch auf sehr kleine exotische
Tiere anzuwenden sind, wenn diese entsprechend im Hinblick
auf die besonderen Gegebenheiten angepasst werden. Andererseits
finden durchaus auch in der Tiermedizin ökologisch motivierte
Arbeiten ihren Platz, zumal sich der Tierarzt zukünftig dem wachsenden
Interesse von Tierbesitzern an exotischen Tierarten nicht
verschließen kann.

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