Schwerpunkt: „Reproduktionsmedizin“ - Tierärztliche Hochschule ...

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Institut für Reproduktionsmedizin der TiHo
Institut für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Mariensee (FAL)
Zentrum für Frauenheilkunde und Zentrum für Anatomie der Georg-August-Universität Göttingen
Die Kohlenhydrate der Zona pellucida des Schweins
Die Analyse der Kohlenhydrate in Gykoproteinen stellt den Analytiker
wegen des hohen Materialbedarfs und der normalerweise
außerordentlichen Heterogenität der Kohlenhydratseitenketten
(Glykane) vor besondere Probleme. Erst mit der Entwicklung der
Massenspektrometrie, hier insbesondere der Entwicklung der
„Matrix-unterstützten Laserdesorption/Ionisation Massenspektrometrie
(MALDI-MS), gelingt es, auch mit geringeren Ausgangsmengen
Glykoproteine zu analysieren. In den neunziger Jahren ist es
M. Nakano, Chiba Universität, Japan, gelungen, die Glykane der
beiden Glykoproteine ZPB und ZPC vollständig in ihrer Struktur aufzuklären,
ihre Verteilung entlang der Moleküle zu bestimmen und
die Struktur und Lokalisation der für die Gametenerkennung verantwortlichen
Glykane zu identifizieren. Die Glykoproteine der porzinen
Zona pellucida sind mit einem Kohlenhydratanteil von etwa 30%
hochglykosyliert. Sie enthalten Glykane, die über die Aminosäuren
Asparagin oder Serin/Threonin verknüpft sind und kurz als N-Glykane
bzw. O-Glykane bezeichnet werden. Die N-Glykane gehören
dem so genannten komplexen Typus an. N- und O-Glykane können
durch sulfatierte Lactosamineinheiten und Neuraminsäuren verlängert
sein (Abb. 3b). Durch die Vielzahl der Modifizierungen sind die
Kohlenhydratstrukturen der ZP außerordentlich heterogen. Es sind
daher nur die häufigsten Glykanstrukturen der porzinen Zona pellucida
in Abbildung 3b schematisch dargestellt.
Auf der Basis dieser Arbeiten konnten nun mittels moderner massenspektrometrischer
Methoden die Kohlenhydratmuster (glycan
profiles) des großen ZPA-Proteins bestimmt und ihre Veränderungen
während Wachstum und Reifung der Eizelle verfolgt werden.
Zona pellucida Glycomics
Die im Wesentlichen massenspektrometrische Analyse der Glykane
in Glykoproteinen wird in Analogie zur proteomics auch glycomics
genannt. Die Untersuchung der Zona pellucida folgt der Methodik
Abb. 3:
a) Die Domänenstruktur der reifen Glykoproteine der Zona pellucida des
Schweins. Die Glykosylierungen sind mit Symbolen dargestellt (für eine Erklärung
siehe Abbildung 2b). Schwarze Balken symbolisieren die Lokalisation der
Cysteinreste. bezeichnet die nicht besetzte potentielle Glykosylierungsstelle
in ZPA.
von glycomics und soll hier kurz schematisch dargestellt werden
(Abb. 4a). Nach elektrophoretischer Trennung von ZPA werden im
Gel die Kohlenhydratseitenketten durch spezifische Enzyme (endo-
Glykosidasen) abgespalten, die freien Glykane aus dem Gel gelöst
und nach Reinigung im MALDI-MS analysiert. Alternativ wird das
Protein im Gel selbst mit Proteasen (vorwiegend Trypsin) gespalten,
die entstehenden Peptide und Glykopeptide aus dem Gel
gelöst und dann ebenfalls massenspektrometrisch analysiert. Dieses
Vorgehen erlaubt die Erstellung der Glykanmuster (glycan profiling,
Abb. 4b) und die Lokalisation der Glykane innerhalb des
Moleküls. Für ZPA konnte damit gezeigt werden, dass dieses Protein
neben den vorher beschriebenen komplexen N-Glykanen eine
weitere Glykanstruktur trägt, die als Oligomannosyl-Glykan
bezeichnet wird (Abb. 3b). Außerdem konnte gezeigt werden, dass
nur fünf der sechs potentiellen Glykosylierungsstellen tatsächlich
Glykane tragen.
Die Reifung der Zona pellucida
Zyklusabhängig wächst die Eizelle im Follikel heran. Zu diesem
Zeitpunkt hat sie die Reduktionsteilung (Meiose) noch nicht vollständig
durchgeführt, d.h. sie hat ihren doppelten Chromosomensatz
(die mütterlichen und väterlichen Chromosomenpaare) noch
nicht vollständig halbiert. Das gelingt erst mit der Ovulation und der
nachfolgenden Befruchtung selbst. Befruchtungskompetent ist nur
die ovulierte, gereifte Eizelle. Die Reifung der Eizelle kann ebenfalls,
wie die eigentliche Befruchtung, in vitro durchgeführt werden
(In-vitro-Maturation, IVM). Es stellte sich nun die Frage, ob es
neben der Reifung des Eizellkerns, des Zytoplasmas und der intrazytoplasmatischen
Organellen auch zu reifungsbedingten Veränderungen
der extrazellulären Matrix kommt. Vergleicht man die Eigenschaften
der Zona pellucida „ungereifter“ Eizellen, die aus Follikeln
gewonnen wurden, mit denen, die einer 2-tägigen In-vitro-Reifung
unterworfen wurden, lassen sich einige entscheidende Unterschiede
feststellen. So hat sich die Kommunikationsfähigkeit mit der
Samenzelle während der Reifung deutlich erhöht. Die von der Zona
b) Die häufigsten Glykane der porzinen Zona pellucida. Die Symbole charakterisieren
bi- (blau), tri- (grau) und tetra- (rot) antennäre komplexe N-Glykane
sowie Oligomannose-Typ N-Glykane (grün).