Isolierung und Charakterisierung von Bakterien aus ...

Material und Methoden
Tabelle 9: PCR-Parameter für die Amplifikation der KS-Domäne der PKS II.
Zusatz Volumen (µl) Konzentration
Primer 945f 1 50pmol/µl
Primer 945r 1 50pmol/µl
Reaktionspuffer 2,5
dNTPs 1 2,5µmol
Taq Polymerase 1 3,5 U
DMSO 2,5
DNA-Template 5
DNA-freies Wasser 11
Tabelle 10: Cyclerparameter für die Amplifikation der KS-Domäne der PKS II.
Funktion Temperatur (°C) Dauer (sec) Zyklen
Denaturierung 96 120 1
Amplifikation 96 60
59,5 120
73 90 32
73 510
Kühlung 10 ∞
Zur Überprüfung der amplifizierten Fragmente, wurden 18 Amplifikate von nicht-
ribosomalen Peptidsynthetasen, acht Amplifikate der Polyketidsynthase I und drei von
der Polyketidsynthase II sequenziert. Die Sequenzierung erfolgte am Institut für Klini-
sche Molekularbiologie des Universitätsklinikums Kiel. Die Sequenzen wurden mit
dem Tool Blastx (Basic Local Alignment Search Tool) der Datenbank NCBI abgegli-
chen (Altschul et al., 1990).
V.3.5 Gelelektrophorese
Zur Überprüfung der Amplifikate wurden alle PCR Produkte auf ein 1,5 % Agarosegel
aufgetragen und bei 200 mV für 20 Minuten laufen gelassen. Die Anfärbung der DNA-
Moleküle erfolgte mit dem nicht-cytotoxischen und nicht-mutagenen Farbstoff
GelGreen TM . Er interkaliert schon in der geringen Konzentration von 1:10000 mit der
DNA, so dass diese unter UV-Licht fluoresziert. Der Farbstoff wurde vor dem Aufko-
chen des Agarosegels hinzugeben.
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