Isolierung und Charakterisierung von Bakterien aus ...

Kapitel 3
die Produktion von Subtilin verschafft sich Bacillus subtilis A1/3 einen Selektionsvor-
teil gegenüber Konkurrenten, muss sich aber gleichzeitig vor der eigenen Substanzwir-
kung schützen (Stein, 2005). Dies kann über einen Konzentrationsmechanismen mit
speziellen Pumpen oder inaktiven Vorstufen geschehen. Die Produktion von Vorstufen
war bislang für die Substanzklasse der nicht-ribosomalen Peptide und Polyketide nicht
bekannt. In Xenorhabdus nematophila ist dies für das Antibiotikum Xenocoumacin und
in E. coli für das NRPS/PKS Hybrid Colibactin, bewiesen worden. Die Vorstufen dieser
Peptide werden erst durch eine Membran gebundene D-Asparagin spezifische Peptidase
aktiviert und danach aus der Zelle ausgeschleust (Dubois et al., 2011; Reimer et al.,
2011).
Viele Wirkstoffe wurden und werden noch durch Kultivierungsversuchen identifiziert.
Eine alternative Strategie bietet die Sequenzierung kompletter bakterieller Genome,
wodurch es seit einiger Zeit möglich ist, das Potential zur Wirkstoffproduktion einzel-
ner Bakterien auf genomischer Ebene abzuschätzen und so auch Gene bzw. Gencluster
für bislang nicht-produzierte Metabolite zu identifizieren. Zurzeit sind über 45 Bacillus
Genome komplett sequenziert und mehr als doppelte so viele sind noch in Bearbeitung
(http://genomesonline.org/cgi-bin/GOLD/bin/gold.cgi, Mai 2012). Das Genom des Re-
ferenzorganismus B. subtilis str168 war das erste Genom eines Gram-positiven Bakteri-
ums welches komplett sequenziert wurde (Barbe et al., 2009; Kunst et al., 1997). Bei
der Annotation zeigte sich, dass in dem Genom von B. subtilis str168 (Größe 4,2 Mb)
rund 4-5 % der Gene für die Antibiotika-Produktion codieren (Stein, 2005). Diese Gene
sind in großen Multienzymkomplexen wie z.B. nicht-ribosomale Peptidsynthetasen und
Polyketidsynthasen zusammengefasst (Kunst et al., 1997). Durch die Vielzahl an bereits
bekannten Wirkstoffen und die ergänzenden Möglichkeiten zur Entdeckung neuer Sub-
stanzen haben Bacillus Arten ein hohes Potential zur Produktion neuer wirksamer Sub-
stanzen.
Auf Grund der Ergebnisse zur biologischen Aktivität und dem Nachweis von NRPS
Genclustern mittels PCR wurde das Isolat gtP20b, dessen nächst verwandter Typstamm
auf 16S rDNA Ebene Bacillus subtilis subsp. spizizenii war, näher bearbeitet. Neben
Kultivierungsversuchen und der chemischen Auswertung der Metabolite wurde zusätz-
lich das Genom des Isolates gtP20b vollständig sequenziert. Damit sollten bekannte
Genclustern den produzierten Substanzen zugeordnet werden, aber auch sogenannte
‘stille’ Gencluster sollten identifiziert werden, um deren mögliche Produkte vorhersagen
zu können.
83