Isolierung und Charakterisierung von Bakterien aus ...

Material und Methoden
V.4 Anzucht und Extraktion von Bakterienkulturen
V.4.1 Anzucht von Bakterien in Flüssigkulturen
Zum Animpfen von Flüssigkulturen wurden die Bakterien aus der Cryobank-Sammlung
aufgetaut und auf einer Agarplatte des jeweiligen Anzuchtmediums angezogen. Daraus
wurden 100 ml Schüttelkulturen unter Verwendung von 300 ml Erlenmeyerkolben an-
geimpft. Diese dienten nach 24 h Inkubation bei 28 °C und 125 rpm zum Animpfen der
Großansätze. Großansätze wurden, wenn nicht anders beschrieben, für 1 Woche bei
28 °C und 125 rpm inkubiert.
V.4.2 Extraktion von Kulturansätzen in 100 ml und 200 ml Maßstab
Um einen ersten Überblick über die biologische Aktivität und produzierten Metabolite
zu bekommen, wurden 304 Isolate in 100 ml bzw. 200 ml Kulturansätzen angeimpft.
Die Anzucht der Isolate erfolgte in dem jeweiligen Wachstumsmedium (TM, GYM30).
Eine genaue Übersicht der Medien und Isolate findet sich im Anhang.
Die Extraktion der Zellen und des Kulturüberstandes erfolgte zusammen. Die Kultur
wurde im Verhältnis 1:1 mit Ethylacetat aufgefüllt und mit dem Ultra-Turax T25 (mind.
30 s lang/13000 Umdrehungen) homogenisiert. Das Homogenisat wurde in einen
Scheidetrichter überführt und gut durchgemischt. Die wässrige Phase wurde verworfen
und die Lösungsmittel-Phase (Extraktphase) mit 50 ml Milli-Q Wasser gewaschen, um
Zellbestandteile zu entfernen. Anschließend wurde die Ethylacetat-Phase in einen
Rundkolben überführt und mittels des Rotationsverdampfers getrocknet.
Der getrockneten Extrakt wurde in 1 ml 100 % Methanol aufgenommen, durch einen
0,2 µm Filter filtriert, in HPLC-Vials überführt und bis zu weiteren Analyse bei -20 °C
gelagert.
V.4.3 Extraktion von Kulturansätzen in 5 L und 10 L Maßstab
Bei Isolaten, die ein interessantes Metabolitmuster aufwiesen, wurden Kulturen von 5
oder 10 Litern angezogen. Dieses erfolgte bei Bacillus subtilis subsp. spizizenii (gtP20b)
in GYM30, TSB, SGCY und Hafermehlmedium, bei Streptomyces sp. (C42) in CN
Medium und bei Bacillus amyloliquefaciens (gtH22, gtH2, gtH1, M2, C4, C5, B45,
D21a, gtK5 und gtI11) in TM und GYM30 Medium.
Die Zellen und der Kulturüberstand wurden separat extrahiert. Dabei stellte sich heraus,
dass sich die Sekundärmetabolite, bei allen untersuchten Stämmen, in größerer Menge
immer in den Zellen befanden. Deshalb wurden nur noch die Zellen weiterbearbeitet
und der Überstand verworfen.
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