Aus dem Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin

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Material und Methoden der weißen Interphase in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß überführt. 780 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) wurden dem Extrakt zugeführt. Nach wiederholtem Schwenken, einer Zentrifugation bei 10.000 g für 5 min wurde der Überstand in ein 1,6 ml Reaktionsgefäß überführt und die DNA durch Zugabe von 500 µl Isopropanol und vorsichtigem Mischen präzipitiert. Nach der Zentrifugation bei 10.000 g für 30 min bei Raumtemperatur wurde das DNA-Sediment durch Zugabe von 500 µl -20°C kalter 80% Ethanol-Lösung gewaschen. Nach 30 min langer Zentrifugation bei 4°C wurde der Überstand abgenommen, die DNA getrocknet und anschließend in 50 µl Wasser (Sigma) über Nacht bei 8°C gelöst. Die DNA-Konzentrationsbestimmung von einer 1:100-Verdünnung erfolgte photometrisch. 3.6 Multiplex-PCR Benötigte Reagenzien: Chromosomale DNA von S. suis 10 x PCR-Puffer 200 mM Tris-HCL pH = 8,4; 500 mM KCL MgCl2-Lösung 50 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP- 100 mM je dNTP Lösungen (dNTP) Taq DNA-Polymerase 5 U/µl Primer-Stammlösungen 50 µM 100 bp DNA Leiter Alle aufgeführten Reagenzien bis auf die Primer wurden von Invitrogen, Karlsruhe, bezogen. In 200 µl PCR-Reaktionsgefäßen wurden 20 ng gereinigte chromosomale DNA in 40 µl reinem Wasser (Sigma) vorgelegt. Anschließend erfolgte die Zugabe von 10 µl eines Mastermixes, so dass im Reaktionsansatz folgende Konzentrationen vorlagen: 1 x PCR-Puffer (20 mM Tris-HCL pH = 8,4; 50 mM KCL); 1,5 mM MgCl2; je 2=0 µM von dATP, dTTP, dCTP und dGTP; 19,8 nM mrpL; 19,8 nM mrpR; 36,5 nM epfL; 36,5 nM epf1BR; 43,8 nM cps1JL; 43,8 nM cps1JR; 35,4 nM cps2JL; 35,4 nM cps2JR; 30,2 nM cps7HL; 30,2 nM 34
Material und Methoden cps7HR; 26,1 nM cps9HL; 26,1 nM cps9HR; 18,8 nM slynewL; 18,8 nM slynewR; 18,8 nM adiSnL; 18,8 nM adiSnR; 20,8 nM gdhsuisL; 20,8 nM gdhsuisR und 2 Units Taq DNA- Polymerase (Tabelle 8). Die Proben durchliefen sofort im Anschluß folgendes PCR- Programm: initiale Denaturierung bei 94°C für 2 min; 30 Zyklen: 1 min bei 94°C, 1 min bei 58°C und 1,30 min bei 72° sowie eine finale Extension bei 72 °C für 2 min. Die Gelelektrophorese von 10 µl des Reaktionsansatzes wurde nach MANIATIS et al. (1989) unter Verwendung der 100 bp DNA Leiter als Größenstandard durchgeführt. Im Anschluß erfolgte die Photographie des Agarosegels und die digitale Verarbeitung (Imago, MWG, München). Tabelle 8: Oligonukleotidprimer-Sequenzen der Multiplex-PCR und mrp-Varianten PCR Gen Primer Sequenz (5’-3’) Position im Gen epf cpsJ1 gdh cpsJ2 cpsH7 cpsH9 sly epf L CGCAGACAACGAAAGATTGA 2401 - 2419 epf1BR AAGAATGTCTTTGGCGATGG 3143 - 3124 cps1JL TGGCTCTGTAGATGATTCTGCT 5288 - 5309 cps1JR TGATACGTCAAAATCCTCACCA 5924 - 5903 gdhsuisL AAGTTCCTCGGTTTTGAGCA 631 - 650 gdhsuisR GCAGCGTATTCTGTCAAACG 1196 - 1177 cps2JL TTTGTCGGGAGGGTTACTTG 13918 - 13937 cps2JR TTTGGAAGCGATTCATCTCC 14415 - 14396 cps7HL AATGCCCTCGTGGAATACAG 3151 - 3170 cps7HR TCCTGACACCAGGACACGTA 3529 - 3510 cps9HL GGGATGATTGCTCGACAGAT 4192 - 4211 cps9HR CCGAAGTATCTGGGCTACTGA 4494 - 4474 slynewL GCTTGACTTACGAGCCACAA 115 - 134 slynewR CCGCGCAATACTGATAAGC 344 - 362 Amplifikat -größe (bp) mrp mrpL mrpR ATTGCTCCACAAGAGGATGG TGAGCTTTACCTGAAGCGGT 3636 - 3655 3823 - 3804 188 adiS adiSnL adiSnR TGATATGGTTGCTGCTGGTC GGACTCGAGGATAGCATTGG 1225 - 1244 1342 - 1324 118 mrp4L GACAGATGGTGAGGAAAATGG 2675 - 2695 a mrp mrpR TGAGCTTTACCTGAAGCGGT 3823 - 3804 a 1148 a a Position im Gen and Amplifikatgröße beziehen sich auf den MRP Referenzstamm D282. 35 744 637 566 498 379 303 248
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Seite 72 und 73: Literatur HAHN, N. u. G. KECH (1995
Seite 74 und 75: Literatur KNORR, H. L. J. u. A. WEB
Seite 76 und 77: Literatur MARTINEZ, G., A. F. PESTA
Seite 78 und 79: Literatur QUINN, P. J., M. E. CARTE
Seite 80 und 81: Literatur STAATS, J., B. PLATTNER,
Seite 82 und 83: WALDMANN, K. H. u. M. WENDT (2004):
Seite 84 und 85:
9 Anhang 9.1 Tabellen Tabelle 15: W
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Tonsille Region FB Anhang FK F? ÜB
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Tonsille Region FB Anhang FK F? ÜB
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Anhang FK F? ÜB ÜK Ü? K B FB Ton
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Isolate Material Herkunft* epf Anha
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Anhang Tabelle 14: Ergebnis der Unt
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