Verbesserte Fluoreszenz-in situ Hybridisierung (FISH ... - Mario Nenno
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2.3.2. Herstellung von Metaphase-Präparaten<br />
Durchführung (modifiziert nach SCHWEIZER (1989)):<br />
- ausgekeimte Samen für 3h bei +4°C kühlen<br />
- Wurzeln 5.5h bei 12-18°C <strong>in</strong> 0.002M 8-Hydroxy-ch<strong>in</strong>ol<strong>in</strong> legen<br />
- Wurzeln <strong>in</strong> gekühltes Fixans (+4°C) überführen, 2 Mal wechseln und<br />
bei -20°C lagern<br />
- Fixans nach e<strong>in</strong>em Tag wechseln und weitere fünf Tage bei -20°C lagern<br />
- Wurzeln <strong>in</strong> 0.1M Citrat-Puffer transferieren<br />
- von den Wurzelspitzen die vordersten 2mm (Meristem) unter dem Stereomikroskop<br />
abtrennen<br />
- Meristeme 2 Mal mit Citrat-Puffer <strong>in</strong> e<strong>in</strong>em Spitzröhrchen durch Dispergieren<br />
und Zentrifugieren (1m<strong>in</strong>, 400xg) waschen<br />
- Meristeme 3h 45m<strong>in</strong> mit e<strong>in</strong>em Cellulase-Pekt<strong>in</strong>ase-Enzymgemisch bei 37°C<br />
<strong>in</strong>kubieren. Während der Inkubation nach jeweils 60m<strong>in</strong> mehrfach mit<br />
silikonisierten Pasteurpipette Luftblasen durch die Enzymlösung blasen, um die<br />
Gewebepartikel schonend zu zerkle<strong>in</strong>ern. Die Gewebe lösen sich im Laufe der<br />
Inkubation auf, was an der Trübung der Enzymlösung erkennbar ist.<br />
- Suspension 2 Mal mit Citrat-Puffer waschen (siehe oben)<br />
- Pellet <strong>in</strong> ca. 1.5ml Citrat-Puffer resuspendieren<br />
- doppeltes Volumen an Fixans zugeben<br />
- 2 Mal mit Fixans durch Dispergieren mit e<strong>in</strong>er silikonisierten Pasteurpipette und<br />
anschließendem Zentrifugieren (1m<strong>in</strong>, 400xg) waschen, um Citrat-Puffer gegen<br />
Fixans auszutauschen<br />
- Pellet abschließend <strong>in</strong> ca. 1.5ml Fixans aufnehmen und dispergieren<br />
- die OT mit Fixans waschen und auf e<strong>in</strong>er Kälteplatte bei -70°C kühlen<br />
- pro Objektträger aus ca. 60cm Höhe 3-5 Tropfen der Zellsuspension auftropfen<br />
- Präparate zum<strong>in</strong>dest über Nacht lufttrocknen<br />
Um die Qualität der Präparate zu beurteilen, wurden e<strong>in</strong> bis zwei Präparate mit 4µl<br />
DAPI/Sulforhodam<strong>in</strong> (STÖHR, 1978) gefärbt und im <strong>Fluoreszenz</strong>mikroskop (400x)<br />
überprüft.<br />
Modifikationen gegenüber SCHWEIZER (1989)<br />
Vor der Behandlung mit 0.002M 8-Hydroxy-ch<strong>in</strong>ol<strong>in</strong> wurden die ausgekeimten<br />
Samen für 3h bei +4°C <strong>in</strong> e<strong>in</strong>en Kühlschrank gestellt.<br />
Die OT wurden nicht auf Eis, sondern auf e<strong>in</strong>er Kälteplatte bei -70°C gekühlt.<br />
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