Verbesserte Fluoreszenz-in situ Hybridisierung (FISH ... - Mario Nenno
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Abb. 24: Schema der <strong>Hybridisierung</strong>smöglichkeiten verschiedener Sonden-DNA-Fragmente. Bei der<br />
Markierung der doppelsträngigen Sonden-DNA entstehen durch nick translation Fragmente, die sich<br />
gegenseitig überlappen. Während der <strong>Hybridisierung</strong> können diese Sonden-DNA-Fragemente <strong>in</strong><br />
e<strong>in</strong>er Konkurenzreaktion entweder mit der Ziel-DNA oder gegenseitig hybridisieren. Durch die<br />
Vernetzung der Fragmente an ihren sich gegenseitig Überlappenden Bereichen, entstehen Ketten aus<br />
Sonden-DNA-Fragmenten. a) Sonden-DNA die nur aus Insert-Sequenzen besteht, bildet nur wenige<br />
Ketten. b) Sonden-DNA, die aus Vektor- und Insert-Sequenzen besteht, enthält zusätzliche Fragmente,<br />
die sich aus Vektor- und komb<strong>in</strong>ierten Vektor- und Insert zusammensetzen. Da die Vektor-<br />
Anteile aber nicht komplementär zur Ziel-Sequenz s<strong>in</strong>d, können sie nur gegenseitig hybridisieren.<br />
Damit tragen sie zu e<strong>in</strong>er weiteren Vernetzung bei. Über die Komb<strong>in</strong>ierten Vektor-Insert-Fragmente<br />
hybridisieren auch diese zusätzlichen verketteten Fragmente mit der Ziel-DNA.<br />
2) Größere Homologie zur Ziel-Sequenz<br />
Für die <strong>Hybridisierung</strong> von Nukle<strong>in</strong>säuremolekülen spielt außer den Hybridisie-<br />
rungsbed<strong>in</strong>gungen die Homologie zwischen den beiden Molekülen e<strong>in</strong>e große Rolle.<br />
Je mehr Fehlpaarungen (mismatches) es zwischen zwei nicht ganz komplementären<br />
Molekülen gibt, um so <strong>in</strong>stabiler ist der hybridisierte Doppelstrang (MEINKOTH UND<br />
WAHL, 1984). Je <strong>in</strong>stabiler aber der Doppelstrang, um so leichter können sich die<br />
beiden Nukle<strong>in</strong>säuremoleküle wieder vone<strong>in</strong>ander lösen und für die Detektion<br />
verloren gehen. Da die chromosomale Zielsequenz aus P. cocc<strong>in</strong>eus stammt, ist es<br />
verständlich, daß die Plasmid-Sonde mit der Phaseol<strong>in</strong>-Sequenz aus P. cocc<strong>in</strong>eus e<strong>in</strong>e<br />
höhere Homologie zur Zielsequenz hat als die 3kb-Insert-Sonde mit der Phaseol<strong>in</strong>-<br />
Sequenz aus P. vulgaris. Genaue Aussagen über den Grad der Homologie s<strong>in</strong>d aber<br />
derzeit nicht möglich, da nur die DNA-Sequenzen für Phaseol<strong>in</strong>-Untere<strong>in</strong>heiten aus P.<br />
vulgaris bekannt ist. Es wird aber an der Sequenzierung des Phaseol<strong>in</strong>-Gens aus P.<br />
cocc<strong>in</strong>eus gearbeitet; bis jetzt s<strong>in</strong>d ca. 400bp bekannt. Unveröffentlichte Ergebnisse<br />
des Vergleiches zwischen dem bisher sequenzierten Teil des Phaseol<strong>in</strong>-Gens aus P.<br />
cocc<strong>in</strong>eus und der Sequenz für die ß-Phaseol<strong>in</strong> Untere<strong>in</strong>heit aus P. vulgaris (ab<br />
Position 96 ab Startcodon ATG) zeigen auf e<strong>in</strong>er Länge von 280bp e<strong>in</strong>en Unterschied<br />
von 3 Basen, also etwa e<strong>in</strong> Prozent Abweichung (R. BLUM, persönliche Mitteilung).<br />
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