Verbesserte Fluoreszenz-in situ Hybridisierung (FISH ... - Mario Nenno

Abb. 24: Schema der Hybridisierungsmöglichkeiten verschiedener Sonden-DNA-Fragmente. Bei der
Markierung der doppelsträngigen Sonden-DNA entstehen durch nick translation Fragmente, die sich
gegenseitig überlappen. Während der Hybridisierung können diese Sonden-DNA-Fragemente in
einer Konkurenzreaktion entweder mit der Ziel-DNA oder gegenseitig hybridisieren. Durch die
Vernetzung der Fragmente an ihren sich gegenseitig Überlappenden Bereichen, entstehen Ketten aus
Sonden-DNA-Fragmenten. a) Sonden-DNA die nur aus Insert-Sequenzen besteht, bildet nur wenige
Ketten. b) Sonden-DNA, die aus Vektor- und Insert-Sequenzen besteht, enthält zusätzliche Fragmente,
die sich aus Vektor- und kombinierten Vektor- und Insert zusammensetzen. Da die Vektor-
Anteile aber nicht komplementär zur Ziel-Sequenz sind, können sie nur gegenseitig hybridisieren.
Damit tragen sie zu einer weiteren Vernetzung bei. Über die Kombinierten Vektor-Insert-Fragmente
hybridisieren auch diese zusätzlichen verketteten Fragmente mit der Ziel-DNA.
2) Größere Homologie zur Ziel-Sequenz
Für die Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen spielt außer den Hybridisie-
rungsbedingungen die Homologie zwischen den beiden Molekülen eine große Rolle.
Je mehr Fehlpaarungen (mismatches) es zwischen zwei nicht ganz komplementären
Molekülen gibt, um so instabiler ist der hybridisierte Doppelstrang (MEINKOTH UND
WAHL, 1984). Je instabiler aber der Doppelstrang, um so leichter können sich die
beiden Nukleinsäuremoleküle wieder voneinander lösen und für die Detektion
verloren gehen. Da die chromosomale Zielsequenz aus P. coccineus stammt, ist es
verständlich, daß die Plasmid-Sonde mit der Phaseolin-Sequenz aus P. coccineus eine
höhere Homologie zur Zielsequenz hat als die 3kb-Insert-Sonde mit der Phaseolin-
Sequenz aus P. vulgaris. Genaue Aussagen über den Grad der Homologie sind aber
derzeit nicht möglich, da nur die DNA-Sequenzen für Phaseolin-Untereinheiten aus P.
vulgaris bekannt ist. Es wird aber an der Sequenzierung des Phaseolin-Gens aus P.
coccineus gearbeitet; bis jetzt sind ca. 400bp bekannt. Unveröffentlichte Ergebnisse
des Vergleiches zwischen dem bisher sequenzierten Teil des Phaseolin-Gens aus P.
coccineus und der Sequenz für die ß-Phaseolin Untereinheit aus P. vulgaris (ab
Position 96 ab Startcodon ATG) zeigen auf einer Länge von 280bp einen Unterschied
von 3 Basen, also etwa ein Prozent Abweichung (R. BLUM, persönliche Mitteilung).
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