Verbesserte Fluoreszenz-in situ Hybridisierung (FISH ... - Mario Nenno

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3.1.2.3. Pepsin Pepsin wurde in verschiedenen Konzentrationen von 50µg, 1mg und 2mg in 0.01N HCl (pH2) eingesetzt. Zunächst wurde die Wirkung von 1mg Pepsin/ml bei 37°C auf die Chromosomenmorphologie beobachtet. Dabei zeigten sich nach 4.5h keine Veränderungen an der Chromosomenstruktur. Auch an den Kontrollpräparaten, die nur mit 0.01N HCl behandelt wurden, konnten keine morphologischen Verände- rungen festgestellt werden. Bei der FISH zeigten die Präparate nach Pepsin/HCl-Vorbehandlung erheblich stärkere Markierungen als die Kontrollpräparate ohne Pepsin/HCl-Vorbehandlung. Stärkere Signale oder stärkere Markierung bedeutet, daß sie aus mehr und dichter liegenden Signalpunkten bestehen als die in den Kontrollpräparaten (vgl. Abbildung 3 und 4). Diese stärkeren Signale waren bereits nach einer Amplifikation gut zu erkennen. Um zu testen, ob allein durch 0.01N HCl eine Verbesserung der Markierung erreicht werden kann, wurden zwei Gruppen von Präparaten nach der FISH verglichen. Eine Gruppe war nur mit 0.01N HCl, die andere mit Pepsin/HCl (1mg/ml) vorbehandelt. Abbildung 5 zeigt Markierungen eines Präparates, das nur mit HCl vorbehandelt wurde. Die Signale sind stärker als ohne Vorbehandlung, aber etwas schwächer als die Signale bei Präparaten mit Pepsin/HCl-Vorbehandlung (Abbildung 4). Es wurde ebenfalls untersucht, ob Variationen der Pepsin-Konzentration eine weitere Verstärkung der Signale bewirken können. Dazu wurden Präparate mit verschiedenen Pepsin-Konzentrationen (50µg/ml, 1mg/ml und 2mg/ml in 0.01N HCl) vorbehandelt und nach der FISH miteinander verglichen. Es zeigte sich, daß Pepsin in einer Konzentratin von 50µg/ml keine stärkere Markierung als 1mg/ml, und 2mg/ml eine schwächere Markierung als 1mg/ml zur Folge hatte. Für alle weiteren Versuche wurde deshalb die Konzentration von 1mg Pepsin/ml gewählt. 30
Abb. 3 - 5: FISH an Riesenchromosomen von Phaseolus coccineus cv. Hammond's Dwarf Scarlet mit rDNA-Sonde (8.8kb-Insert, pTA250). Die Vorbehandlungen mit Pepsin bzw. HCl erfolgten jeweils 4.5h bei 37°C. Gegenfärbung der Chromosomen mit Propidiumiodid. Abb. 3: Markierungen ohne Pepsin/HCl-Vorbehandlung. Die einzelnen Signalpunkte liegen nicht sehr dicht (Pfeile). Die Markierung ist schwach. Abb. 4: Markierungen nach Pepsin/HCl-Vorbehandlung (1mg Pepsin/ml in 0.01N HCl). Starke Markierungen an sechs Riesenchromosomen (Pfeile). Die Signalpunkte liegen dicht nebeneinander. Abb. 5: Markierungen nach HCl-Vorbehandlung (0.01N HCl) auf zwei Chromosomen mit aufgelockerten NORs. Gegenfärbung der Chromosomen mit Propidiumiodid. Maßstab 25µm. 31
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