Verbesserte Fluoreszenz-in situ Hybridisierung (FISH ... - Mario Nenno
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DABCO: 1,4-di-azobicyclo-(2,2,2)-oktan (Sigma, D-2522)<br />
DAPI: 4',6-Diamid<strong>in</strong>o-2-phenyl-<strong>in</strong>dol.2HCl.H 2 0 (SERVA, 18860)<br />
Propidiumiodid (Sigma, P-4170)<br />
Glycer<strong>in</strong> für die <strong>Fluoreszenz</strong>mikroskopie (Merck, 4095)<br />
Antifade-Lösung: 1 Teil Tris-HCl pH 7.4 und 9 Teile Glycer<strong>in</strong> mit 2.3% (w/v) DABCO und 0.02%<br />
Na-Azid<br />
2.6.7. <strong>FISH</strong>s <strong>in</strong> der Übersicht<br />
In der folgenden Tabelle (Tabelle 3) s<strong>in</strong>d die wichtigen Parameter der <strong>Fluoreszenz</strong>-<strong>in</strong><br />
<strong>situ</strong> <strong>Hybridisierung</strong>en mit Biot<strong>in</strong>-markierten Sonden zusammengefaßt. S<strong>in</strong>d zwei oder<br />
mehr Methoden für e<strong>in</strong>en Arbeitsgang angegeben, so s<strong>in</strong>d sie als Alternativen<br />
aufzufassen.<br />
Tab. 3: <strong>FISH</strong>s mit Vorbehandlungen und DNA-Sonden im Überblick<br />
Arbeitsgang Methoden<br />
Vorbehandlung Abbau von Prote<strong>in</strong>en mit Proteasen:<br />
der Präparate - Tryps<strong>in</strong><br />
- Prote<strong>in</strong>ase K<br />
- Peps<strong>in</strong><br />
Abbau der RNA mit RNase A<br />
Sonden - rDNA aus Triticum aestivum<br />
- b-Phaseol<strong>in</strong>-Gen aus Phaseolus vulgaris<br />
- Phaseol<strong>in</strong>-Gen aus Phaseolus cocc<strong>in</strong>eus<br />
Denaturierung 70% Formamid <strong>in</strong> 2x SSC<br />
<strong>Hybridisierung</strong> 12-18 h bei 37°C<br />
Str<strong>in</strong>genzwaschungen 3 Mal 3m<strong>in</strong> <strong>in</strong> 2x SSC bei 42°C und 3 Mal<br />
2m<strong>in</strong> <strong>in</strong> BT-Puffer bei 42°C<br />
Indirekte Detektionen - ExtrAvid<strong>in</strong>-FITC (gelbgrün)<br />
Amplifikation mit biot<strong>in</strong>yliertem Anti-Avid<strong>in</strong><br />
Direkte Detektion FITC-dUTP<br />
- ExtrAvid<strong>in</strong>-TRITC (rot)<br />
Amplifikation mit biot<strong>in</strong>yliertem Anti-Avid<strong>in</strong><br />
- Streptavid<strong>in</strong>-FITC (gelbgrün)<br />
Amplifikation mit biot<strong>in</strong>yliertem Anti-<br />
Streptavid<strong>in</strong><br />
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