Verbesserte Fluoreszenz-in situ Hybridisierung (FISH ... - Mario Nenno

Trypsin
Die ersten Versuche mit Trypsin-Vorbehandlung bei Phaseolus Riesenchromosomen
wurden von KÖHLER (1992) durchgeführt. Trypsin, das als Vorbehandlung für die G-
Bänderungstechnik bereits seit längerer Zeit Verwendung findet (COMINGS et al.,
1973), wurde dazu mit der in der G-Bänderung üblichen Konzentration von 0.5ml
Bacto Trypsin in 70ml 0.9% NaCl (entspricht 0.357mg Trypsin 1:250/ml 0.9% NaCl)
und einer verlängerten Inkubationsdauer von 1h angewendet. Diese Vorbehandlung
veränderte die Morphologie der Riesenchromosomen nicht, und brachte bei der FISH
keine stärkere Markierung als die Kontrollen. In der vorliegenden Arbeit wurde
Trypsin deshalb mit der 10fachen Konzentration eingesetzt und die Inkubationsdauer
von 1h und auf 9.5h ausgedehnt. Weder die höhere Konzentration noch die
Kombination mit der verlängerten Inkubationszeit bewirkten eine deutliche
Verbesserung der Signale bei der FISH. Die Chromosomenmorphologie blieb bei allen
Versuchen mit Trypsin-Vorbehandlung unverändert.
Proteinase K
Weitere Versuche wurden mit Proteinase K durchgeführt, einer Protease, die für die
ISH an Ultra-Dünnschnitten in der Elektronenmikroskopie (LEITCH et al., 1992), aber
auch als Vorbehandlung für die FISH (PINKEL, 1986; KALLIONIEMI et al., 1992)
verwendet wird, und daher besonders geeignet erschien. Die Beobachtungen im
Mikroskop zeigten, daß sich die Riesenchromosomen bei Behandlung mit Proteinase
K (500µg Proteinase K/ml in Proteinase K-Puffer) bereits nach 1h aufgelöst waren.
Daher wurde die Inkubationszeit auf 5min reduziert. Die Markierung war bei den
Riesenchromosomen mit 5minütiger Proteinase K-Vorbehandlung etwas stärker als
bei den unbehandelten Kontrollen, aber bedingt durch erste Auflösungserscheinungen
der Chromosomen lagen sie stark zerstreut. Der Grund für das rasche Auflösen der
Chromosomen dürfte wohl darin liegen, daß Proteinase K die Peptidbindungen
zwischen allen Aminosäuren außer Prolin hydrolysieren kann, was zu einem schnellen
Abbau aller Proteine führt. Daß Proteinase K dennoch auch zur Vorbehandlung bei
pflanzlichen Objekten geeignet ist, zeigen die Ergebnisse bei Arabidopsis thaliana
(BAUWENS et al., 1991). Für die Verwendung bei Phaseolus-Riesenchromosomen
müßten jedoch Konzentration und Inkubationszeit erst weiter angepaßt werden.
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