Verbesserte Fluoreszenz-in situ Hybridisierung (FISH ... - Mario Nenno

wurde zum ersten Mal 1991 in der Diplomarbeit von BAUMANN berichtet. In der Abt.
Zellbiologie der Universität Kaiserslautern wurde dann zwar mehrfach versucht, die
Phaseolin-Gene auch durch FISH zu lokalisieren, was aber nicht gelang.
Wahrscheinlich lag der Grund in der ungenügenden Zugänglichkeit der Zielsequenzen
für die Sonde und/oder das Detektionssystem.
4.2 Abbau von Proteinen
Da die Zugänglichkeit von der Packungsdichte der DNA im Chromatin abhängig ist,
und diese durch chromosomale Proteine (Histone, Nichthiston-Proteine) bestimmt
wird, muß den chromosomalen Proteinen ein entscheidender Einfluß auf die
Zugänglichkeit beigemessen werden (HARRIS, 1992). Bereits 1988 beobachteten
SIMPSON et al. an Quetschpräparaten von Pisum, daß die Signale bei der
nichtradioaktiven in situ Hybridisierung durch die Vorbehandlung mit Pronase, einem
protein-spaltendem Enzym, verbessert wurden. Allerdings wurde auch die Struktur
der Chromosomen deutlich angegriffen. Ähnliche Schwierigkeiten traten auch beim
Einsatz von Proteinase K auf. Entweder war die Konzentration zu gering und zeigte
keine Verbesserung der Signale gegenüber der Kontrolle, oder sie war zu hoch und
zerstörte die Morphologie, sodaß die Chromosomen nicht mehr zu identifizieren
waren (MOURAS et al., 1989). Erst in jüngerer Zeit gibt es Hinweise darauf, daß
Proteinase K mit Erfolg zur Vorbehandlung eingesetzt werden kann (BAUWENS et al.,
1991).
Es wurde deshalb untersucht, ob sich durch den Abbau von Proteinen in Präparaten
von Riesenchromosomen aus Phaseolus coccineus die FISH verbessern läßt, sodaß
sich auch low-copy Gene wie Phaseolin lokalisieren lassen.
Dazu wurden die Proteine in Riesenchromosomen-Präparaten mit Hilfe von ver-
schiedenen protein-spaltenden Enzymen (Proteasen) enzymatisch abgebaut und die
Auswirkungen dieser Vorbehandlungen auf die FISH verglichen. Als Test-System
diente die FISH mit einer rDNA-Sonde nach BAUMANN (1991). Wenn der Abbau der
Proteine einen Einfluß auf die Zugänglichkeit der Zielsequenz hat, sollte sich dies bei
der Test-FISH mit der rDNA-Sonde durch stärkere Signale als bisher zeigen. Die
Wirkung der drei Endopeptidasen Trypsin, Proteinase K und Pepsin wurden dabei
untersucht.
43