Verbesserte Fluoreszenz-in situ Hybridisierung (FISH ... - Mario Nenno

Material:
Aufsicht-Stereomikroskop, 0.8-6.4x (STEMI SV8, Zeiss)
Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Ortholux)
Zentrifuge (Hermle, ZK364)
Kälteplatte (FTS Systems)
Spitzröhrchen
Pasteurpipette, silikonisiert
Objektträger
Chemikalien:
8-Hydroxy-chinolin, puriss. p.a. (Fluka, 55070)
DAPI, 4',6-Diamidino-2-phenyl-indol.2HCl.H 2 0 (SERVA, 18860)
Glycerin für die Fluoreszenzmikroskopie (Merck, 4095)
Sulforhodamin 101 lasergrade (EASTMAN Kodak, 14318)
Tris: Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Sigma, T-1378)
Cellulase, Onozuka R10 (201057)
Pektinase, EC 3.2.1.15 from Aspergillus niger Solution in 40% Glycerol 3-9U/mg Protein (Sigma, P-
5146)
Lösungen:
0.1M Citrat-Puffer, pH 4.8
0.002M 8-Hydroxy-chinolin in A. dest
Methanol-Eisessig (3+1), frisch ansetzen
DAPI/Sulforhodamin (1ml):
500µl Sulforhodamin-Gebrauchslösung
(3mg Sulforhodamin 101 in 100ml 0.2M Tris-HCl pH 7.5)
499µl Glycerin
1µl DAPI-Stammlösung (1mg DAPI/ml Wasser)
Cellulase-Pektinase-Enzymgemisch: 2% (w/v) Cellulase; 40% (v/v) Pektinase in 0.01M Citrat-Puffer
pH 4.8
2.4 Gen-Sonden
Die Herstellung der Gen-Sonden soll hier nur allgemein beschrieben werden, da mir
die Sonden bereits mit Biotin markiert zur Verfügung gestellt wurden. Die wichtigsten
Angaben über die verwendeten Methoden bzw. Chemikalien sind im jeweiligen
Abschnitt ergänzt.
2.4.1. Sonde für ribosomale RNA-Gene
Die rRNA-Gene, die bei Pflanzen die größeren ribosomalen RNA-Moleküle (5.8S,
18S, 25S rRNA) kodieren (rDNA), sind zu sogenannten Repetitionseinheiten (repeat
units) zusammengefaßt. Sie liegen bei Pflanzen im allgemeinen in der Größenordnung
von 10.000 Kopien pro Genom vor (GERLACH und BEDBROOK, 1979). Phaseolus
coccineus besitzt pro Telophase-Kern 4000 Kopien der rDNA (INGLE et al., 1975).
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