Verbesserte Fluoreszenz-in situ Hybridisierung (FISH ... - Mario Nenno

Die Stringenz-Bedingungen bei der Hybridisierung, der Stringenzwaschung und der
weiteren Waschschritte erlaubten jedoch immer mehr als 14% Fehlpaarung (86%
Homologie). Selbst wenn der Unterschied in den Sequenzen zwischen P. coccineus
und P. vulgaris bis zur vollständigen Sequenzierung von 1 auf 2 Prozent steigt (was
dem Unterschied zwischen den Genen für die α- und ß-Phaseolin-Untereinheiten
entsprechen würde) liegt dies noch immer deutlich unter den hier erlaubten 14
Prozent. Damit scheint es unwahrscheinlich, daß die Unterschiede in der Homologie
zwischen Zielsequenz und den Phaseolin-Genen der beiden Sonden für die
verschieden starken Signale verantwortlich sind.
Kreuzhybridisierungen
Für den Vektor pBR322 der 3kb-Insert-Sonde wurde von BAUMANN (1991) gezeigt,
daß bei der Hybridisierung mit 35 S-markiertem Vektor keine Markierungen auf den
Chromosomen zu beobachten waren. Für den Vektor pUC18 der Plasmid-Sonde
wurde ein solcher Test nicht durchgeführt. Im Vergleich zu den Signalen der 3kb-
Insert-Sonde waren die Signale der Plasmid-Sonde aber genauso spezifisch (vgl.
Abbildungen 15 und 16). Kreuzhybridisierungen zwischen dem Vektor der Plasmid-
Sonde und der chromosomalen DNA sind somit nicht wahrscheinlich.
ISHs bei Pflanzen
Während die FISH inzwischen die dominierende Form der in situ Hybridisierung bei
Untersuchungen an Chromosomen von Menschen geworden ist und sich bereits
single-copy Gene mit einer Länge von nur 500bp nachweisen lassen (LEMIEUX,
1992), hat sie bei Untersuchungen an pflanzlichen Objekten erst in den letzten Jahren
zunehmend an Bedeutung zu gewonnen. Bei Pflanzen wurde sie bisher nur zur
Analyse der Verteilung von mittelrepetitiven rRNA-Genen (LEITCH et al., 1992;
GRIFFOR et al., 1991) und der Lokalisation repetitiver Sequenzen wie Telomer
Repeats (RAWLINS et al., 1991; SCHWARZACHER und HESLOP-HARRISON et al.,
1991), Tandem Repeats (LEITCH et al., 1991; MALUSZYNSKA und HESLOP-
HARRISON, 1991) und Dispersed Sequences (JOUVE et al., 1991) eingesetzt. Der
Nachweis von single- und low-copy Genen bei Pflanzen erfolgte meistens jedoch
durch radioaktive ISH (HUANG et al., 1988, 6.6kb single-copy; MOURAS et al., 1989,
1.6kb single-copy ; HUANG et al., 1989, 1.9kb single-copy; SCHUMANN et al, 1990,
1.4kb low-copy). Nur selten gelang die Lokalisation von single- und low-copy Genen
durch nichtradioaktive ISH. In allen beschriebenen Fällen kam dabei auch nicht die
FISH, sondern die Enzym-katalysierten Farbreaktionen zur Anwendung (SIMPSON et
al., 1988, 13.5kb single-copy; GUSTAFSON, et al., 1990, 900pb low-copy).
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