Verbesserte Fluoreszenz-in situ Hybridisierung (FISH ... - Mario Nenno

In diesem Zusammenhang ist die Lokalisation der Phaseolin-Gene an Riesenchro-
mosomen von Phaseolus coccineus durch FISH für den Fortschritt in der nichtra-
dioaktive ISH von Interesse. Denn es wurden damit erstmals DNA-Sequenzen mit
einer Länge von ca. 1800bp (Insert-Sequenz der Plasmid-Sonde aus P. coccineus),
die im haploidem Genom als low-copy Gene vorliegen, auf polytänen Riesenchro-
mosomen von Pflanzen durch FISH lokalisiert.
4.5 FISH mit rDNA-Sonde an mitotischen Chromosomen
Bei der FISH mit rDNA-Sonde an mitotischen Chromosomen aus dem Wurzel-
meristem von Phaseolus coccineus cv. Hammond's Dwarf Scarlet fanden sich pro
Kern 5 oder 6 Signale (Abbildung 19). Eine Identifizierung der einzelnen Chromo-
somen war aufgrund ihrer geringen Größe und der wenigen ausreichend guten Prä-
parate nicht möglich. Die Anzahl von 5 bis 6 NORs steht in Einklang mit den Be-
obachtungen von SCHWEIZER und AMBROS (1979), die bei ihren Untersuchungen mit
Silberfärbung im Durchschnitt 5.5 NORs pro Kern nachweisen konnten, was auf 6
Nukleolus-organisierende Chromosomen hinweist.
Dies entspricht der Zahl von markierten Nucleolus-organisierenden Riesenchromo-
somen bei der FISH mit rDNA-Sonde (BAUMANN, 1991; Ergebnisse dieser Arbeit).
4.6 Signale der Detektionssysteme
Das hier hauptsächlich verwendete Avidin/Biotin-System ist ein indirektes Detek-
tionssystem. Biotin wird dabei als Reportermolekül, z.B. in Form von Biotin-dUTP, in
die Sonden-DNA eingebaut und nach der Hybridisierung durch die Detektion mit
konjugiertem Avidin nachgewiesen. Für den Nachweis ist Avidin entweder mit einem
fluoreszierenden Farbstoff (z.B. FITC) oder einem Enzym, das eine Farbreaktion
katalysiert, gekoppelt.
Beim Nachweis mit Avidin, das mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt ist (z.B.
Avidin-FITC), kann man zu schwache Signale durch eine sog. Amplifikation ver-
stärken (PINKEL et al., 1986). Dazu inkubiert man mit einem Antikörper gegen
Avidin, der mit Biotin konjugiert ist, und gibt erneut Avidin-FITC hinzu. Dadurch
erhöht sich die Anzahl der FITC-Moleküle und die Markierung wird stärker. Anstelle
von Avidin wurden hier die Derivate ExtrAvidin bzw. Streptavidin verwendet. Sie
besitzen zwar eine geringere Bindungsaffinität zu Biotin, zeichnen sich aber durch
weniger unspezifische Bindungseigenschaften aus, wodurch ein besseres
Signal/Hintergrund-Verhältnis erreicht wird.
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