Taxonomia, distribuição geográfica e filogenia do gênero Codium

Oliveira-Carvalho, M. F. Taxonomia, distribuição geográfica e filogenia ... 65
PCR, foram utilizados mini-tubos contendo as seguintes proporções: 39,25 μL de H2O
miliq; 5μL de tampão 10X; 1,5 μL de MgCl2; 1μL de dNTP; 1 μL de cada primer; 1 μL
de DNA total e 0,25 μL de Taq DNA polymerase, tendo volume final 50 μL. Os mini-
tubos foram conduzidos para reação de PCR em termocilador Minicycler TM , (MJ
Research) nos seguintes ciclos: 94 0 C por 4 min; 35X (94 0 C por 30 seg, 45 0 C por 1 min;
72 0 C por 2 min) e 72 0 C por 7 min. O produto da PCR foi visualizado e qualificado em
eletroforese em gel de agarose 0,7% corado com brometo de etídio conforme descrito
acima (Sambrook et al. 1989).
Purificação do produto da PCR. Para minimizar eventuais erros de
incorporação de bases durante a PCR, foram realizadas três reações de PCR
independentes para cada amostra de DNA, as quais foram reunidas antes da purificação
(Baldwin et al. 1995). Os produtos obtidos foram purificados em colunas de
MicroSpin TM (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire), conforme o protocolo
do fornecedor. O DNA purificado foi analisado em gel de agarose a 0,7% conforme
descrito acima e quantificado através da comparação com marcador padrão (1 KB
Ladder) da Invitrogen através da estimativa visual.
Sequenciamento. A reação de sequenciamento foi feita com aproximadamente
40 ng do produto de DNA purificado, através do kit de sequenciamento “BigDye TM
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction” da Applied Biosystems (Foster City,
EUA). O kit de seqüenciamento é constituído por dNTP, dideoxinucleosídeos (ddNTP)
com marcadores fluorescentes, tampão, cloreto de magnésio e enzima Taq polimerase.
Para cada reação de seqüenciamento foram utilizadas as seguintes proporções: 2 μL de
BigDye; 2 a 5 μL do DNA purificado (dependendo da amostra) e 1 μL de primer (10
pmol). No sequenciamento, foi utilizado o primer 12-34F para as seqüências diretas e o