Ed. 114 - NewsLab

Figura 1. Os cinco estágios da formação do
biofilme.
Fonte: Sauer et al., 2002
Figuras 2 e 3. Exemplar de placa após período de incubação. Observação de intenso
crescimento microbiano
bactérias e apresentar formação de
biofilme em sua superfície.
O presente trabalho tem como
objetivo analisar os bucais dos bebedouros
para uma possível colonização
bacteriana e, se esses microrganismos
forem formadores de biofilme,
alertar para uma melhoria na higienização
dos mesmos.
Metodologia
Foram utilizados 12 bebedouros
situados em locais diferentes de uma
Faculdade de Maringá, PR. Inicialmente,
foram coletadas amostras
dos bucais de todos os bebedouros
com swabs estéreis. As amostras foram
semeadas, de forma estéril, em
placas de petri contendo meio BHI
Agar. Em seguida, foram incubadas
a 36ºC por 72H horas, para que se
proliferassem as bactérias.
Após esse período, foi verificado
crescimento bacteriano em todas as
placas (Figuras 2 e 3), sendo selecionadas
algumas colônias, para reisolamento
das amostras, totalizando 44
amostras em meio BHI Agar.
Foi realizada a técnica de coloração
de gram, seguindo o procedimento desenvolvido
por Hans Gram, em 1884.
A coloração de Gram é um método de
coloração diferencial, que por meio da
retenção ou não do corante cristal-
-violeta permite classificar as bactérias
em gram-positivas ou gram-negativas,
devido às diferenças em suas paredes
celulares. Após a secagem, visualizou-
-se ao microscópio óptico, com a objetiva
de 100X, em óleo de imersão.
Posteriormente, foram feitas provas
bioquímicas, onde foram evidenciadas
as atividades das enzimas
coagulase e catalase. Ambos os testes
foram realizados como recomendado
pelo Manual da Agência Nacional de
Vigilância Sanitária para identificação
de bactérias de interesse médico.
O método da coagulase foi realizado
sobre a lâmina, da seguinte forma:
uma pequena porção da colônia foi homogeneizada
em uma gota de salina,
em seguida foi colocada uma gota de
plasma sanguíneo. Após alguns minutos,
pode-se visualizar a formação de
coágulos, sendo considerada a prova
positiva. Para a prova da catalase, as
colônias foram homogeneizadas da
mesma forma, sendo acrescentada
uma gota de peróxido de hidrogênio
20 V. O aparecimento de bolhas foi
interpretado como catalase positiva.
A mensuração da camada de biofilme
foi realizada em microplacas de
poliestireno com fundo em “U”, como
descrito por Shin et al. (2002) (17),
porém com algumas modificações.
As amostras bacterianas foram inoculadas
em caldo BHI, a 37°C por 24
horas. Após este período, a densidade
celular foi ajustada para 1,5x10 8 UFC/
mL. Em seguida, foram transferidos
para cada poço 100µL de caldo BHI
e 100µL (3,0x10 7 UFC) da suspensão
bacteriana. O controle negativo foi
realizado utilizando-se 200µL de caldo
BHI estéril. As placas foram incubadas
a 37°C por 24 horas sem agitação.
Após 24 horas de incubação,
as placas foram lavadas com água
deionizada estéril e 200µL de água
deionizada foram adicionados a cada
poço, para leitura em espectrofotômetro.
A transmitância (%T) foi avaliada
em 405 nm e o valor de cada teste foi
obtido através da seguinte equação:
%T bloqueada = %T teste - %T
branco da reação
A %T bloqueada corresponde à
quantidade de luz bloqueada após
atravessar cada poço. A produção de
biofilme foi avaliada como negativa
(%T bloqueada < 5); + (%T bloqueada
= 5-20); ++ (%T bloqueada =
20-35); +++ (%T bloqueada = 35-
50); ++++ (%T bloqueada = 50).
Cada teste foi realizado em triplicata.
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NewsLab - edição 114 - 2012