Revista Analytica Edição 129

Artigo 3
Como exemplo de
mudança na eluição por
gradiente podemos citar
o método de teor de Cloridrato
de Difenidramina
da USP. A Tabela 3 mostra
os parâmetros do método
original com coluna
contendo PTP de 5 µm e
as mudanças realizadas
para PSP de 2,7 µm.
Tabela 2: Requerimentos para mudar as condições do gradiente de eluição:
Passo 1: Seleção das novas dimensões da coluna
dentro do intervalo permitido.
L/dp: -25% to +50% de PTP para PTP
ou (tttttttt/wwwwwwww) 2222 : -25% to +50% de PTP para PSP
Passo 2: Ajustar o fluxo de acordo com as novas
dimensões da coluna.
F 2 = F 1 [(dc 2
2
× dp 1)/(dc 1
2
× dp 2)]
Passo 3: Ajustar cada segmento de tempo do
gradiente.
t G2 = t G1 × (F 1/F 2) [(L 2 × dc 22 )/(L 1 × dc 12 )]
Passo 4: Ajustar o volume de injeção.
V inj2 = V inj1 × [(L 2 ×dc 22 )/(L 1× dc 1
2
)]
Onde:
L Comprimento da coluna
dp Diâmetro da partícula
F 1 Fluxo no método original
F 2 Fluxo no novo método
dc 1 Diâmetro interno da coluna inicial
dc 2 Diâmetro interno da nova coluna
dp 1 Tamanho da partícula da coluna
inicial
dp 2 Tamanho da partícula da nova
coluna
t G1 Tempo do gradiente original
t G2 Novo tempo do gradiente
V inj1 Volume de injeção inicial
V inj2 Novo volume de injeção
L1 Comprimento da coluna inicial
L2 Comprimento da nova coluna
tr Tempo de retenção do pico
wh Largura do pico a meia altura.
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Revista Analytica | Março 2024
A Figura 2 abaixo mostra
o cromatograma da
adequação do sistema
para o método de teor
de Cloridrato de Difenidramina
da USP já otimizado
utilizando o UHPLC
e a coluna Agilent InfinityLab
Poroshell 120
EC-C8. Os tempos de
retenção relativo para o
composto relacionado
A da Difenidramina e a
Difenidramina são 0,9 e
1,0; respectivamente.
Para esse estudo foi utilizado
o UHPLC 1290, mas
como a pressão máxima
não ultrapassou 408 bar,
obtida com o método
otimizado e com a coluna
InfinityLab Poroshell
120 EC-C8, 4,6 x 100 mm;
Tabela 3: Comparação dos métodos com mudança na eluição por gradiente.
Método Original da
USP
2,7 µm, poderia ter sido
utilizado um HPLC. Nesse
caso, aumentaria a dispersão
e os tempos de
retenção dos compostos,
já que o volume morto
do HPLC é maior que o do
UHPLC. A pressão máxima
no sistema utilizando
a coluna Zorbax Eclipse
Método usando HPLC
Coluna L7 4,6 x 250 mm; 5 µm Agilent ZORBAX Eclipse Plus
C8
4,6 x 250 mm; 5 µm
(tr/Wh) 2
de -25 à 50% do método
Difenidramina
original
Método usando UHPLC
2.410 (1.805 à 3615) 2.778 (+15,3 %)
Agilent InfinityLab Poroshell 120
EC-C8, 4,6 x 100 mm; 2,7 µm
Fase Móvel
A) Tampão: 5,4 g/L de fosfato monobásico de potássio, ajustar com ácido fosfórico para pH
3,0
B) Acetonitrila
Diluente: Acetonitrila e tampão (35:65)
Fluxo 1,2 mL/min. 1,2 mL/min. 1,8 mL/min.
Gradiente
Tempo
Tempo
Tempo
B %
B %
(min)
(min)
(min)
B %
0 35
0 35
0 35
4 35
4 35
1,1 35
7 80
7 80
1,9 80
9 35
9 35
2,4 35
13 35
13 35
3,5 35
Temperatura Não indicada 25 ˚C 25 ˚C
Volume de Injeção* 10 µL 10 µL 4 µL
Detecção UV 220 nm Sinal DAD em 220 nm, Sinal DAD em 220 nm, referência
referência off, 5 Hz
off, 40 Hz
Tempo de Corrida 13 min. 13 min. 3,5 min.
*Pode ser ajustado se for consistente com a precisão, linearidade e limites de detecção aceitos.
Plus C8 4,6 x 250 mm;
5 µm chegou a 280 bar.
As partículas superficialmente
porosas (PSP) e de
menor tamanho (2,7 µm)
contribuíram para que a
eficiência ((tr/Wh)2) fosse
15,3 % maior com a coluna
Poroshell do que com
a coluna Zorbax de partí-