Revista Analytica Edição 129

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Artigo 3 Como exemplo de mudança na eluição por gradiente podemos citar o método de teor de Cloridrato de Difenidramina da USP. A Tabela 3 mostra os parâmetros do método original com coluna contendo PTP de 5 µm e as mudanças realizadas para PSP de 2,7 µm. Tabela 2: Requerimentos para mudar as condições do gradiente de eluição: Passo 1: Seleção das novas dimensões da coluna dentro do intervalo permitido. L/dp: -25% to +50% de PTP para PTP ou (tttttttt/wwwwwwww) 2222 : -25% to +50% de PTP para PSP Passo 2: Ajustar o fluxo de acordo com as novas dimensões da coluna. F 2 = F 1 [(dc 2 2 × dp 1)/(dc 1 2 × dp 2)] Passo 3: Ajustar cada segmento de tempo do gradiente. t G2 = t G1 × (F 1/F 2) [(L 2 × dc 22 )/(L 1 × dc 12 )] Passo 4: Ajustar o volume de injeção. V inj2 = V inj1 × [(L 2 ×dc 22 )/(L 1× dc 1 2 )] Onde: L Comprimento da coluna dp Diâmetro da partícula F 1 Fluxo no método original F 2 Fluxo no novo método dc 1 Diâmetro interno da coluna inicial dc 2 Diâmetro interno da nova coluna dp 1 Tamanho da partícula da coluna inicial dp 2 Tamanho da partícula da nova coluna t G1 Tempo do gradiente original t G2 Novo tempo do gradiente V inj1 Volume de injeção inicial V inj2 Novo volume de injeção L1 Comprimento da coluna inicial L2 Comprimento da nova coluna tr Tempo de retenção do pico wh Largura do pico a meia altura. 28 Revista Analytica | Março 2024 A Figura 2 abaixo mostra o cromatograma da adequação do sistema para o método de teor de Cloridrato de Difenidramina da USP já otimizado utilizando o UHPLC e a coluna Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C8. Os tempos de retenção relativo para o composto relacionado A da Difenidramina e a Difenidramina são 0,9 e 1,0; respectivamente. Para esse estudo foi utilizado o UHPLC 1290, mas como a pressão máxima não ultrapassou 408 bar, obtida com o método otimizado e com a coluna InfinityLab Poroshell 120 EC-C8, 4,6 x 100 mm; Tabela 3: Comparação dos métodos com mudança na eluição por gradiente. Método Original da USP 2,7 µm, poderia ter sido utilizado um HPLC. Nesse caso, aumentaria a dispersão e os tempos de retenção dos compostos, já que o volume morto do HPLC é maior que o do UHPLC. A pressão máxima no sistema utilizando a coluna Zorbax Eclipse Método usando HPLC Coluna L7 4,6 x 250 mm; 5 µm Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8 4,6 x 250 mm; 5 µm (tr/Wh) 2 de -25 à 50% do método Difenidramina original Método usando UHPLC 2.410 (1.805 à 3615) 2.778 (+15,3 %) Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C8, 4,6 x 100 mm; 2,7 µm Fase Móvel A) Tampão: 5,4 g/L de fosfato monobásico de potássio, ajustar com ácido fosfórico para pH 3,0 B) Acetonitrila Diluente: Acetonitrila e tampão (35:65) Fluxo 1,2 mL/min. 1,2 mL/min. 1,8 mL/min. Gradiente Tempo Tempo Tempo B % B % (min) (min) (min) B % 0 35 0 35 0 35 4 35 4 35 1,1 35 7 80 7 80 1,9 80 9 35 9 35 2,4 35 13 35 13 35 3,5 35 Temperatura Não indicada 25 ˚C 25 ˚C Volume de Injeção* 10 µL 10 µL 4 µL Detecção UV 220 nm Sinal DAD em 220 nm, Sinal DAD em 220 nm, referência referência off, 5 Hz off, 40 Hz Tempo de Corrida 13 min. 13 min. 3,5 min. *Pode ser ajustado se for consistente com a precisão, linearidade e limites de detecção aceitos. Plus C8 4,6 x 250 mm; 5 µm chegou a 280 bar. As partículas superficialmente porosas (PSP) e de menor tamanho (2,7 µm) contribuíram para que a eficiência ((tr/Wh)2) fosse 15,3 % maior com a coluna Poroshell do que com a coluna Zorbax de partí-
culas totalmente porosas (PTP) de 5 µm, (Tabela 3), mesmo usando a coluna Poroshell de menor comprimento (100 mm). No cromatograma da Figura 3, obtido com o método original, o tempo de retenção do pico da Difenidramina foi 4,997 min., enquanto que com o método otimizado (Figura 4), esse tempo foi 1,417 min.; que representa uma economia de tempo de aproximadamente 72%. Isso representa economia de solvente da fase móvel (menos descarte de solvente) e aumento da produtividade do laboratório. Os relatos acima desse estudo mostram que aproveitar os benefícios das novas tecnologias para a melhoria contínua na eficiência e sustentabilidade das análises, já fazem parte do dia a dia dos laboratórios. Referências: Fu, R.; Grover M.; Freeman R.; Long, W. Understanding the Latest Revisions to USP , Nota de Aplicação da Agilent Technologies 5994-6618EN online: https://www. agilent.com/cs/library/whitepaper/public/wpusp-621-5994-6618en-agilent.pdf Long, W. J. A Simple Conversion of the USP Assay Method for Diphenhydramine HCl to the Agilent InfinityLab Poroshell 120 Column EC-C8, Nota de Aplicação da Agilent Technologies 5994 5400EN online: https://www.agilent.com/cs/library/ applications/an-conversion-usp-assay-methodzorbax-poroshell120-5994-5400en-agilent.pdf Documento Técnico da Agilent Tecnologies 5990-3333PTBR online: https://www.agilent. com/cs/library/brochures/5990-3333PTBR.pdf USP General Chapter Chromatography – versão official 30-abril-2023 online DOI: https:// doi.org/10.31003/USPNF_M99380_07_01 Monografia Oficial da USP: Diphenhydramine Hydrochloride online DOI: https://doi. org/10.31003/USPNF_M27130_04_01 Napolitano-Tabares, P.; Negrín-Santamaría, I.;Gutiérrez-Serpa, A and Pino,V. Recent efforts to increase greenness in chromatography – Review online: https://www.sciencedirect.com/journal/ current-opinion-in-green-and-sustainablechemistry/special-issue/10SZ60KSCZ3 Andrea Lucia Rezemini Bacharel em Química com Mestrado e Doutorado em Química Analítica pela USP. Vinte anos de experiência em diferentes laboratórios. Entre as diferentes técnicas analíticas, HPLC, GC, MS, FTIR, UV-Vis e KF foram as mais utilizadas para análises químicas, desenvolvimento e validação de métodos. No trabalho anterior, na United States Pharmacopeia, atuou no desenvolvimento de Padrões de Referência durante doze anos (2008 – 2020). Atualmente ocupa a função de Cientista de Aplicações para os consumíveis da Agilent Technologies. Gabriel Nobrega da Rocha Martins Bacharel e Mestre em Química pela USP, com 20 anos de experiencia em química analítica. Atuando com instrumentação analítica nos últimos quinze anos, especializado em Cromatografia Líquida, sendo que os últimos 12 anos foram dedicados ao trabalho na Agilent Technologies, como especialista de campo e cientista de aplicação. Revista Analytica | Março 2024 29
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