cache

แลวนําไปวิเคราะหปริมาณเอทิลีนดวยเครื่อง Gas Chromatograph (GC) เก็บตัวอยางกาซวันละ 1
ครั้ง เปนเวลา 5 วัน หลังจากเก็บตัวอยางกาซแลวเปดโหลออกทุกครั้ง อัตราการผลิตเอทิลีนมี
หนวยเปนนาโนลิตรตอกรัมตอชั่วโมง ในการวัดอัตราการผลิตเอทิลีนนี้ทําทั้งหมด 5 ซ้ํา ๆ ละ 1 โหล
แตละโหลบรรจุดอกกลวยไม 2 ชอ
อีกสวนหนึ่งนําใชเปนตัวอยางวิเคราะหหากิจกรรมเอนไซม ACC synthase และปริมาณ
ACC ตามวิธีของ Hoffman and Yang (1982) รายงานผลการวิเคราะหกิจกรรมเอนไซม ACC
synthase และปริมาณ ACC โดยแยกเปนดอกตูม เสาเกสรและกลีบดอกของดอกบาน
1. วิเคราะหกิจกรรมของ ACC synthase ตามวิธีการของ Hoffman และ Yang (1982)
การสกัด นําตัวอยางดอกกลวยไมที่แชแข็งมาชั่งน้ําหนักแลวเติมสารละลาย homologenization
buffer (ประกอบดวย N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N’-(3-propane-sulfonic acid) (EPPS) buffer
ความเขมขน 100 mM dithiothreitol (DTT) ความเขมขน 4 mM และ pyridoxal phosphate
ความเขมขน 0.5 µM แลวปรับ pH เปน 8.5 ดวยโพแทสเซียมไฮดรอกไซด (KOH) ในอัตราสวน
1:2 (น้ําหนักตอปริมาตร) ใชโกรงและสากที่เย็นจัดบดตัวอยางใหละเอียด กรองดวยผากรอง
ที่มีความหนา 4 ชั้น นําไปเหวี่ยงดวยเครื่องเหวี่ยงที่แรงเหวี่ยง 12,000 xg นาน 20 นาที
นําเฉพาะสวนใสที่สกัดไดมาทํา dialysis สารละลายเอนไซม ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส
นานประมาณ 24 ชั่วโมง บันทึกน้ําหนักดอกกลวยไมที่ใชในการสกัด และปริมาตรสารละลาย
หลังจากการ dialysis ของดอกกลวยไม
การวิเคราะห นําสารละลายเอนไซมที่ dialysis แลวปริมาตร 400 µl
ใสในหลอดทดลองขนาด 7 ml 6 หลอด เติม incubation buffer (ประกอบดวย EPPS ความเขมขน
600 mM ที่ pH 8.5) ปริมาตร 50 µl สารละลาย SAM ความเขมขน 0.5 mM ปริมาตร 60 µl
และน้ํากลั่นปริมาตร 90 µl เขยาเบา ๆ ใหเขากัน แลวอบที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส นาน 3 ชั่วโมง
นําหลอดทดลอง แชในอางน้ําแข็ง โดย 3 หลอดแรกเปนตัวอยาง เติม HgCl 2 ความเขมขน 10 mM
ปริมาตร 100 µl และน้ํากลั่นปริมาตร 200 µl สวน 3 หลอดหลังเปน internal standard
มีสวนผสมของสารละลายเอนไซมที่อบแลว SAM และ HgCl 2 เชนเดียวกันแตเพิ่มน้ํากลั่นปริมาตร
150 µl และสารละลาย ACC มาตรฐานความเขมขน 0.04 mM ปริมาตร 50 µl
หลังจากเติมสารแลวปดปากหลอดดวยจุกยางใหแนน แลวใชหลอดฉีดยาฉีดสารละลายผสมที่เย็น
18