cache

ของ NaOH อิ่มตัวและ NaOCl เขมขน 5.25 เปอรเซ็นต อัตราสวน 1:2 (ปริมาตรตอปริมาตร)
ปริมาตร 100 µl (ประมาณ 10 หยด) ลงในหลอดทดลอง ผสมใหเขากันโดยใชเครื่องเขยา
แลวนําหลอดทดลองแชในอางน้ําแข็ง เพื่อใหปฏิกิริยาดําเนินไป เปนเวลา 3 นาที จากน ั้น
ผสมใหเขากันโดยใชเครื่องเขยาอีกครั้ง แลวใชหลอดฉีดยาดูดอากาศ ภายในหลอดทดลอง
เหนือสารละลายเขาออก 10-15 ครั้ง กอนเก็บตัวอยางอากาศปริมาตร 1 ml ฉีดเขาเครื่อง GC
เพื่อตรวจสอบปริมาณเอทิลีนจากตัวอยางอากาศ ซึ่งมีคาเปนสวนในลานสวน (พีพีเอ็ม)
แลวนําคาเอทิลีนที่ไดไปคํานวณหากิจกรรมของเอนไซม ACC synthase มีหนวยเปนนาโนโมลของ
ACC ตอกรัมตอชั่วโมง
2. วิเคราะหปริมาณ ACC ตามวิธีการของ Hoffman and Yang (1982)
การสกัด นําดอกกลวยไมที่แชแข็งมาไวที่อุณหภูมิหองประมาณ 5-10 นาที
เพื่อใหเนื้อเยื่อออนตัวลง จากนั้นชั่งน้ําหนักดอกกลวยไมและสกัดดวย trichloroacetic acid (TCA)
เขมขน 9 เปอรเซ็นต ในอัตราสวน 1:2 (น้ําหนักตอปริมาตร) (เพื่อให TCA เขาสูเนื้อเยื่อประมาณ 6
เปอรเซ็นต) โดยปนดวยเครื่อง homogenizer ใหละเอียด และเก็บไวที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส
เปนเวลา 24 ชั่วโมง แลวนําไปเหวี่ยงดวยเครื่องเหวี่ยง 27,000 xg เปนเวลา 20 นาที
รินเฉพาะสารละลาย ACC ของดอกกลวยไมที่สกัดได (เปนสารละลายสีชมพู มีลักษณะหนืด)
มาทําใหเปนกลาง โดยคอย ๆ หยดสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด (NaOH) เขมขน 1 N
ลงไปทีละหยด พรอมทั้งวัด pH และคนสารละลายตลอดเวลา จนกระทั่งได pH ประมาณ 7-8
(สารละลายจะคอย ๆ เปลี่ยนจากสีชมพูเปนสีเขียว) บันทึกน้ําหนักดอกกลวยไมที่ใชในการสกัด
และปริมาตรสารละลาย ACC ของดอกกลวยไมที่สกัดไดซึ่งปรับใหเปนกลางแลว
การวิเคราะห ใสสารละลายตัวอยางลงในหลอดทดลองขนาด 7 ml ตัวอยางละ 6 หลอด ๆ
ละ 500 µl โดย 3 หลอดแรกเปนตัวอยาง เติมสารละลาย HgCl 2 เขมขน 10 mM ปริมาตร 100 µl
และน้ํากลั่นปริมาตร 300 µl สวน 3 หลอดหลังเปน internal standard ซึ่งเติมสวนผสมเทากับ 3
หลอดแรกแตลดปริมาณน้ํากลั่นลงเหลือ 250 µl และเติมสารละลาย ACC มาตรฐาน เขมขน 0.04 mM
ปริมาตร 50 µl หลังจากเติมสารแลวปดปากหลอดดวยจุกยางใหแนน แลวใชหลอดฉีดยา
ฉีดสารละลายผสมที่เย็นของ NaOH อิ่มตัว และ NaOCl เขมขน 5.25 เปอรเซ็นต อัตราสวน 1:2
(ปริมาตรตอปริมาตร) ปริมาตร 100 µl (ประมาณ 10 หยด) ลงในหลอดทดลอง ผสมใหเขากัน
โดยใชเครื่องเขยา แลวนําหลอดทดลองแชในอางน้ําแข็งเพื่อใหปฏิกิริยาดําเนินไปเปนเวลา 3 นาที
19