Vankomisine Dirençli Enterokoklar (VRE) - EKMUD
Vankomisine Dirençli Enterokoklar (VRE) - EKMUD
Vankomisine Dirençli Enterokoklar (VRE) - EKMUD
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
işlemlerinin kapalı tek tüp içinde yapıldığı bu<br />
yöntem, DNA izolasyonunu takiben 1.5-2 saat<br />
içerisinde tamamlanmakta, RIF’a ve INH’ye dirençli<br />
olan suşların tamamı doğru olarak saptanabilmektedir<br />
(6,32). RIF direncinin saptanmasında<br />
kullanılan gerçek zamanlı PCR yönteminin<br />
diğer bir uygulama şeklinde “molecular beacon”<br />
olarak adlandırılan hibridizasyon problarından<br />
yararlanılmaktadır (33). Aynı reaksiyon tüpü<br />
içerisinde her biri farklı renkte floresans verebilen<br />
madde ile işaretli 5 hibridizasyon probu kullanılmaktadır.<br />
Bu problardan her biri RIF’a duyarlı<br />
tüberküloz basillerinin rpoB genindeki farklı<br />
bir hedef dizilimin komplementeridir. PCR<br />
amplifikasyonu sırasında “molecular beacon”lar<br />
tek sarmallı amplikonlarla hibridize olduklarında<br />
renk sinyalleri oluşmaktadır. Eğer amplifiye<br />
edilen rpoB geninde herhangi bir mutasyon<br />
yoksa probların 5 tanesi de hibridize olarak, 5<br />
farklı renkte floresans gözlenmektedir. Bir veya<br />
daha fazla mutasyon olan izolatlarda, bu mutasyon<br />
noktası ile ilişkili problarla hibridizasyon olmayacağından<br />
onlara ait renk sinyalleri alınamayacaktır.<br />
RIF direncini saptamada yöntemin duyarlılığı<br />
%89-98, özgüllüğü %99-100 olarak bulunmuş<br />
ve mikroskopisi pozitif örneklere doğrudan<br />
uygulanabileceği gösterilmiştir (17). INH direncini<br />
saptamada duyarlılık daha düşüktür.<br />
Multipleks alel spesifik PCR (MAS-PCR)<br />
yönteminde rpoB genindeki 516, 526 ve 531. kodonları<br />
ve ayrıca katG genindeki 315. kodondaki<br />
mutasyonlar, alel spesifik primerler yardımıyla<br />
araştırılmaktadır. Her bir PCR için iki dış (outer),<br />
bir iç (inner) primer kullanılmaktadır. Her<br />
kodon için kullanılacak olan iç primerlerin 3’<br />
ucu, araştırılacak kodonun mutasyona uğramamış<br />
(wild-type) haldeki baz diziliminde 2. sırada<br />
yer alan bazla eşleşecek şekilde düzenlenmiştir.<br />
Böylece araştırılacak olan kodonda mutasyon<br />
varlığında amplifikasyon olmayacak, mutasyon<br />
olmadığında DNA çoğalması gerçekleşecektir<br />
(7,34,35). MAS-PCR rpoB geninin 531 ve 516.<br />
kodonlarındaki mutasyonları belirlemede dizi<br />
analizi ile %100 uyumlu bulunmuştur (7,35).<br />
Buna karşın 526. kodondaki mutasyonu saptamada<br />
yöntemin duyarlılığı düşüktür. KatG geninin<br />
315. kodonundaki mutasyonu saptamada dizi<br />
analiziyle %94 uyum gözlenmiştir (7). Diğer<br />
bir çalışmada MAS-PCR yöntemiyle INH, RIF ve<br />
EMB direncinden sorumlu mutasyonlar araştırıl-<br />
Rıza Durmaz<br />
mış; yöntemin duyarlılık ve özgüllüğü INH için<br />
%81 ve %97.5, RIF için %93 ve %98.9, EMB için<br />
%54.5 ve %68 olarak kaydedilmiştir (25).<br />
Yeni yayınlanmış olan bir makalede M. tuberculosis<br />
genomunun herhangi bir lokasyonundaki<br />
genotipe özgü mutasyonlar ve direnç oluşumundan<br />
sorumlu mutasyonların aynı anda saptanmasına<br />
olanak veren bir “multipleks ligasyonprob<br />
amplifikasyon (MLPA)” yöntemi geliştirilmiştir.<br />
Bu yöntemle RIF’a dirençli suşların<br />
%71’inde, INH’ye dirençli suşların ise %80’inde<br />
dirençle ilgili mutasyonlar doğru olarak saptanabilmiştir<br />
(36).<br />
Heterodupleks analizi dirence neden olan<br />
mutasyonların belirlenmesinde kullanımı kolay<br />
olan yöntemlerdendir. Klinik örnekten üretilen M.<br />
tuberculosis suşunun dirençten sorumlu gen bölgesi<br />
ile duyarlı olduğu bilinen M. tuberculosis suşunun<br />
DNA’ları ayrı ayrı çoğaltılır. Çoğaltılmış<br />
ürünler eşit miktarlarda bir tüp içerisinde karıştırılır.<br />
Sonra ısıtılarak çift sarmal olan DNA zincirlerinin<br />
birbirinden ayrılması sağlanır. Karışım oda<br />
sıcaklığına gelinceye kadar soğutulur. Böylece heterodupleks<br />
ve homoduplekslerin oluşması sağlanır.<br />
Karışım elektroforeze tabi tutularak homo ve<br />
heterodublekslerin ayrışması sağlanır. Hastaya ait<br />
bakteriden gelen gende mutasyon yoksa, homojen<br />
bir DNA dubleksi oluşacağından elektroforezde<br />
tek bant gözlenecektir. Mutasyon varsa; mutasyon<br />
noktasında eşleşme bozukluğu olur, çifte sarmal<br />
yapısı bozulur. Bu farklılık DNA’nın jel elektroforezde<br />
farklı hızda yürümesine neden olur ve birden<br />
fazla bant gözlenir (37). RIF direncini saptamada<br />
bu yöntemin duyarlılık ve özgüllüğü sırasıyla<br />
%92.7 ve %100 olarak bulunmuştur (38).<br />
SONUÇ<br />
Tüberküloz tedavisinde beklenen sonucun alınabilmesi<br />
için in vitro antibiyotik duyarlılık test<br />
sonuçları mutlaka gereklidir. Fenotipik yöntemlerden<br />
proporsiyon yöntemi CLSI tarafından önerilen<br />
altın standart olma özelliğini korumaktadır.<br />
Moleküler testlerle özellikle RIF ve INH direnci<br />
kısa sürede saptanabilmektedir, ancak bu yöntemler<br />
henüz CLSI önerileri arasına girmemiştir.<br />
Duyarlılık testlerinde hızlı sonuç verme önemlidir.<br />
Fakat ondan daha da önemlisi doğru ve güvenilir<br />
sonuçların verilmesidir. Bunun için duyarlılık<br />
çalışan laboratuvarların iç ve dış kalite kontrol<br />
programlarına katılmaları teşvik edilmelidir.<br />
2. Türkiye <strong>EKMUD</strong> Bilimsel Platformu 2009 79
Change language