Wechselwirkungen der V-ATPasevon Manduca sexta mit dem Aktin ...

Methoden
Aktinfilamente wurden mittels FITC-Phalloidin visualisiert. Dafür wurden die
Schnitte zuerst wie beschrieben geblockt und dann mit 160 nM FITC-Phalloidin 40 Minuten
bei Raumtemperatur in PBS-Blockpuffer inkubiert. Nach dreimaligem Waschen (je 5 Minu-
ten) in PBS-Puffer und dem Einbetten in Mowiol wurden die Schnitte im Fluoreszenz-
Mikroskop mit NIBA-Filter oder im konfokalen Laser-Scanning Mikroskop bei λex=488 nm
und λem=515 nm analysiert.
3.1.2. Präparation des V1Vo-Holoenzyms
Die Reinigung des V1Vo-Holoenzyms aus Rohhomogenat von ganzem Mitteldarm
erfolgte nach einem in der Arbeitsgruppe etablierten Protokoll (Huss, 2001; Huss et al.,
2002), das es ermöglicht, etwa 1 mg reines Protein aus 20 Raupen des fünften Larvenstadiums
zu isolieren.
Dafür wurden die herauspräparierten Därme zuerst in kaltem SETP mit einem Ultra-
turrax (IKA, Deutschland) 30 s bei 20.500 rpm homogenisiert. Nach einer Zentrifugation von
5 Minuten bei 10.000 x g und 4°C (JA 25.50, Beckman) wurde das Pellet in SETP resuspen-
diert und wieder unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert. Erneut wurde das Pellet in
SETP-Puffer resuspendiert und schließlich 30 Minuten bei 200.000 x g und 4°C (90 Ti,
Beckman) sedimentiert. Danach wurde das Pellet in TEM-Puffer mit 0,1 % C12E10 bei 4°C so-
lubilisiert und 1 Stunde bei 200.000 x g und 4°C (90 Ti, Beckman) zentrifugiert. Der Über-
stand wurde durch eine Membran mit einer Porengröße von 0,22 µm filtriert und durch Ultra-
filtration in einer Rührzelle (10 kDa Ausschlussgröße, Amicon) unter Druck ankonzentriert.
Das Konzentrat von maximal 4 Därmen wurde auf jeweils einen diskontinuierlichen Saccha-
rosegradienten (3 ml 40 %, 2 ml 30 %, 2 ml 20 % und 1,6 ml 10 % Saccharose (wt/vol) in
TEM-Puffer mit 0,01 % C12E10 und 0,2 M KCl) aufgetragen. Nach einer Zentrifugation von
90 Minuten bei 310.000 x g und 4°C (VTi 65.1, Beckman) wurden die 30 %-Fraktionen etwa
vierfach mit LOMC-Puffer verdünnt und auf eine Anionenaustauscher-Säule (Hyper D Q
Säule, Biosepra) aufgetragen. In einem linearen Gradienten von 50 bis 400 mM NaCl in
LOMC-Puffer eluierte das Holoenzym zwischen 230 und 280 mM NaCl. Die gewünschten
Fraktionen wurden zusammengemischt und mit einem Zentrifugalkonzentrator (100 kDa
Ausschlussgröße, Centricon) auf 100 µl ankonzentriert. Das Konzentrat wurde auf eine Gel-
permeations-Säule (Superdex 200, Amersham-Pharmacia Biotechnology Inc.) aufgetragen
und das V1Vo-Holoenzym in LOMC-Puffer mit 150 mM NaCl endgültig chromatographisch
gereinigt.
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