Wechselwirkungen der V-ATPasevon Manduca sexta mit dem Aktin ...

Methoden
Um zu überprüfen, ob die Untereinheit C im Zytosol auch frei vom V1-Komplex
existiert, wurden 5 Mitteldärme des fünften Larvenstadiums in 3 ml F-Puffer mit 5 mM Pe-
fabloc SC vorsichtig mit einem Glashomogenisator (Wheaton) homogenisiert, um das Aktin-
Zytoskelett zu erhalten. Danach wurde das Homogenat 5 Minuten bei 10.000 x g und 4°C
zentrifugiert, um es von Zellbruchstücken zu befreien, und der Überstand anschließend 1
Stunde bei 200.000 x g und 4°C zentrifugiert, um Aktinfilamente und die das V1Vo-
Holoenzym enthaltende Membranen zu entfernen. Nach der Zugabe von ß-Mercaptoethanol
bis einer Konzentration von 9,6 mM wurde der Überstand auf einen diskontinuierlichen Sac-
charosegradienten (3 ml 40 %, 2 ml 30 %, 2 ml 20 % und 1,6 ml 10 % Saccharose (wt/vol) in
TEM-Puffer mit 0,2 M NaCl) aufgetragen und 90 Minuten bei 310.000 x g und 4°C (VTi
65.1, Beckman) zentrifugiert. Fraktionen, die der Verteilung von Crec entsprachen, wurden zu-
sammengemischt und auf ein SDS-Gel aufgetragen. Als Kontrolle wurden die den V1-
Komplex enthaltenden Fraktionen (3.1.3.) eingesetzt. Nach SDS-PAGE und Western Blot
wurde die Untereinheit C mittels Immunfärbung (3.1.13.) mit einem monoklonalen Antikör-
per detektiert.
3.1.18. Interaktion mit NBD-gekoppeltem G-Aktin
Die Analyse der Wechselwirkung von Proteinen mit NBD-gekoppeltem G-Aktin ist
eine einfache und zuverlässige Methode, vorausgesetzt, die Bindung an G-Aktin führt zu ei-
ner Konformationsänderung, die sich fluorimetrisch erfassen lässt (Carlier et al., 1997; Var-
tiainen et al., 2002). Die Herstellung von NBD (7-Chloro-4-nitrobenzono-2-oxa-1,3-diazol)-
Aktin nach Detmers et al. (1981) startete mit der Kopplung von N-Ethylmaleimid an Lysin
372 des Aktins. Hierzu wurde 45 µM G-Aktin mit 0,5 mM N-Ethylmaleimid (NEM) unter
Aktin-polymerisierenden Bedingungen (5 mM Tris-HCl (pH 8,0), 2 mM MgCl2, 0,1 M KCl
und 0,2 mM DTT) zuerst 15 Minuten bei Raumtemperatur, dann 15 Minuten bei 15°C und
schließlich 2,5 Stunden bei 2°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von DTT bis zu
einer Endkonzentration von 1 mM gestoppt und polymerisiertes NEM-Aktin wurde durch
einstündige Zentrifugation bei 100.000 x g und 4°C pelletiert. Das NEM-Aktin wurde in 10
mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM ATP, 0,1 M KCl und 2 mM MgCl2 re-
suspendiert, bis etwa 1 mg/ml verdünnt und 5 Stunden bei 15°C mit 0,4 mM NBD-Cl inku-
biert. Das entstehende NBD-F-Aktin wurde durch zweistündige Sedimentation bei 100.000 x
g und 4°C pelletiert und danach in G-Puffer resuspendiert. Nach vollständiger Dialyse gegen
G-Puffer und zweistündiger Zentrifugation bei 100.000 x g und 4°C enthielt der Überstand
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