Wechselwirkungen der V-ATPasevon Manduca sexta mit dem Aktin ...

Methoden
3.1.21. Pelletierung von gebündeltem Aktin
Um gebündelte Aktinfilamente nachzuweisen, wurde eine Zentrifugation bei 20.000
x g statt 100.000 bis 200.000 x g durchgeführt (Robinson et al., 2002; Fraley et al., 2003;
Kron et al., 1991). Zunächst wurde 10 µM G-Aktin in Gegenwart von 0,4 µM Gelsolin (Cy-
toskeleton) polymerisiert, um gleichmäßig lange Aktinfilamente zu erhalten. Nach Stabilisie-
rung mit 10 µM Phalloidin wurde 0,4 µM F-Aktin mit ca. 0,2 µM Untereinheit C 90 Minuten
bei 4°C inkubiert. Die Pellets und Überstände nach zwanzigminütiger Zentrifugation bei
20.000 x g und 4°C wurden per SDS-PAGE und Silber-Färbung analysiert.
3.1.22. Fluoreszenz-Mikroskopie von Aktinfilamenten
Nach Polymerisierung in F-Puffer und Stabilisierung mit 10 µM FITC-Phalloidin
wurde F-Aktin in einer Konzentration von 6,6 µM mit Fluoreszenz-Puffer (Kron et al., 1991)
1:2 verdünnt und 15 Minuten bei 20.000 x g und 4°C zentrifugiert, um mögliche Aggregate
zu entfernen. 0,2 µM des so vorbereiteten F-Aktins wurde mit 14 µM Untereinheit C in 10
mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,25 mM NaCl, 0,25 mM KCl, 0,5 mM MgCl2, 50 mM DTT, 10
µg/ml Katalase, 0,05 mg/ml Glukose-Oxidase, 1,5 mg/ml Glukose und 0,05 % NLS 30 Minu-
ten bei Raumtemperatur inkubiert. 3µl der Suspension wurden auf Super Frost Plus-
Objektträger (Menzel-Gläser) aufgetragen und fluoreszenzmikroskopisch visualisiert (Olym-
pus IX 70, U-MWIB Filter, 100x Uplan-Apo-Objektiv (NA 1.35)). Als Software diente
Olympus DP-Soft SVI.
3.1.23. Nachweis der Oligomerisierung von rekombinanter Untereinheit C
im Saccharosedichtegradienten
Um zu überprüfen, ob die rekombinante Untereinheit C unter oxidierenden Bedin-
gungen Dimere und/oder Oligomere bildet, wurde eine Zentrifugation im Saccharosedich-
tegradienten, modifiziert nach Vartiainen et al. (2000), durchgeführt. 0,3 ml Untereinheit C in
einer Konzentration von 0,35 mg/ml in LO-Puffer wurden auf einen kontinuierlichen Saccha-
rosegradienten (5 % bis 20 %, wt/vol; in TEK-Puffer) aufgetragen. Als Kontrolle wurden et-
wa 0,6 mg einer Protein-Mischung (Kalibrierungs-Kit von Amersham Biosciences), die Ka-
ninchenmuskel-Phosphorylase b (97kDa), Rinderserumalbumin (66 kDa) und Hühnereiweiß-
Ovalbumin (45 kDa) in 0,3 ml LO-Puffer enthielt, auf einen anderen Gradienten geschichtet.
Nach 3,5-stündiger Zentrifugation bei 310.000 x g und 4°C in einem Vertikalrotor (VTi 65.1,
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