Wechselwirkungen der V-ATPasevon Manduca sexta mit dem Aktin ...

Wechselwirkungen der V-ATPase
von Manduca sexta
mit dem Aktin-Zytoskelett
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
eingereicht am Fachbereich Biologie/Chemie
der Universität Osnabrück
Olga Vitavska
aus Fastiv, Ukraine
Osnabrück, Januar 2005

Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
Inhaltsverzeichnis
1.1. V-ATPasen: Biologische Funktionen, Struktur und Regulation 5
1.2. Aktinfilamente als eine Komponente des Zytoskeletts 10
1.3. Wechselwirkung des Aktin-Zytoskeletts
mit Transmembranproteinen 13
2. Material
2.1. Chemikalien, Enzyme und Antikörper 19
2.2. Medien und Puffer 20
2.3. Versuchstiere 22
3. Methoden
3.1. Biochemische und zellbiologische Methoden
3.1.1. Immunfärbung der Gefrierschnitte 23
3.1.2. Präparation des V1Vo-Holoenzyms 24
3.1.3. Präparation des V1-Komplexes 25
3.1.4. Reinigung der rekombinanten Untereinheit C mittels einer Ni-NTA-Säule 25
3.1.5. Reinigung rekombinanter Proteine aus Inclusionbodies 26
3.1.6. Präparation des Aktins aus Kaninchenmuskel 26
3.1.7. Co-Pelletierung mit Aktinfilamenten 27
3.1.8. Proteinbestimmung 27
3.1.9. SDS-PAGE 28
3.1.10. SDS-Gel-Färbung mit Coomassie 28
1

Inhaltsverzeichnis
3.1.11. SDS-Gel-Färbung mit Silbernitrat 28
3.1.12. Western Blot 29
3.1.13. Immunfärbung 29
3.1.14. Overlayblot mit G- und F-Aktin 30
3.1.15. Co-Präzipitation des zytosolischen Aktins mit rekombinanter Untereinheit C 30
3.1.16. Reassoziation des V1-Komplexes mit rekombinanter Untereinheit C 31
3.1.17. Nachweis der freien Untereinheit C im Zytosol von Manduca 31
3.1.18. Interaktion mit NBD-gekoppeltem G-Aktin 32
3.1.19. Aktin-Depolymerisierung 33
3.1.20. Lichtstreuung 33
3.1.21. Pelletierung von gebündeltem Aktin 34
3.1.22. Fluoreszenz-Mikroskopie von Aktinfilamenten 34
3.1.23. Nachweis der Oligomerisierung von rekombinanter Untereinheit C
im Saccharosedichtegradienten 34
3.1.24. Phosphoprotein-Färbung im SDS-Gel 35
3.1.25. Autophosphorylierung 35
3.1.26. Protein Kinase A-katalysierte Phosphorylierung 35
3.2. Molekularbiologische Methoden
3.2.1. Polymerase-Kettenreaktion 36
3.2.2. Agarosegelelektrophorese 36
3.2.3. Ligation und Transformation 36
3.2.4. Herstellung kompetenter Zellen 37
3.2.5. Herstellung rekombinanter Proteine 37
3.2.6. Injektion von siRNA 38
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4. Ergebnisse
4.1. Interaktion der V-ATPase aus Manduca mit Aktinfilamenten
Inhaltsverzeichnis
4.1.1. Co-Lokalisation der V-ATPase mit Aktinfilamenten 39
4.1.2. Co-Pelletierung des V1Vo-Holoenzyms und des V1-Komplexes mit Aktin 40
4.1.3. Sowohl Untereinheit B als auch Untereinheit C vermitteln
die Bindung an Aktin 42
4.1.4. Co-Pelletierung der Untereinheit C mit F-Aktin 43
4.1.5. Untereinheit C interagiert mit F-Aktin aus Manduca 44
4.1.6. Untereinheit C erhöht die Affinität des V1-Komplexes zu Aktin 45
4.2. Interaktion der Untereinheit C mit F- und G-Aktin
4.2.1. Nachweis der freien Untereinheit C im Zytosol von Tabakschwärmerraupen 46
4.2.2. Untereinheit C bindet sowohl F- als auch G-Aktin 47
4.2.3. Untereinheit C stabilisiert Aktinfilamente und beschleunigt
die Polymerisierung des Aktins 50
4.2.4. Bündelung der Aktinfilamente durch die Untereinheit C 52
4.2.5. Aktin-Bindungsstellen der Untereinheit C 54
4.2.6. Dimerisierung und Oligomerisierung der Untereinheit C 55
4.3. Weitere Eigenschaften der Untereinheit C: Vorversuche 57
4.3.1. RNA-Interferenz
4.3.1.1. Phänotypische Änderungen bei der Entwicklung der Raupen 58
4.3.1.2. Änderungen in der Struktur des Mitteldarms 60
4.3.2. Phosphorylierung der Untereinheit C
4.3.2.1. Autophosphorylierung 61
4.3.2.2. Phosphorylierung durch Proteinkinase A 62
3

Inhaltsverzeichnis
5. Diskussion 65
5.1. Interaktion mit Aktinfilamenten als generelle Eigenschaft von
V-ATPasen 66
5.2. Die V-ATPase als Anker des Aktin-Zytoskeletts
zur Plasmamembran 68
5.3. Vergleich der Untereinheit C mit regulatorischen
Aktin-bindenden Proteinen 70
5.4. Aktin-Bindungsstellen der Untereinheit C 73
5.5. Biologische Rolle der Untereinheit C 76
5.6. Phosphorylierung der Untereinheit C: Fakten und Spekulationen 78
6. Zusammenfassung 81
7. Literaturverzeichnis 83
8. Publikationen 97
9. Abkürzungsverzeichnis 99
10. Lebenslauf 101
11. Danksagung 103
12. Erklärung 105
4

1. Einleitung
1.1. V-ATPasen: Biologische Funktionen, Struktur und Regulation
Einleitung
V-ATPasen sind Protonen-Pumpen und kommen in jeder eukaryotischen Zelle vor.
Entdeckt wurden sie in Chromaffin-Granula, wo sie den Transport von Catecholaminen ener-
getisieren (Kirshner, 1962; Njus and Radda, 1978). Die Lokalisierung im vakuolären System
der Zelle war ausschlaggebend für die Benennung dieses Typs von Ionenpumpen als V-
ATPasen (Nelson, 1992). Inzwischen weiß man, dass es für V-ATPasen zwei prinzipielle Lo-
kalisationen in der Zelle gibt. Sie kommen nicht nur in Endomembranen vor, wie im Fall der
sauren Organellen, sondern auch in Plasmamembranen, wie bei Osteoklasten oder in be-
stimmten Epithelien von Insekten (Stevens and Forgac, 1997; Wieczorek et al., 1999).
In beiden Fällen katalysieren V-ATPasen die Hydrolyse von ATP, wobei sie die ent-
stehende Energie für den aktiven Transport von Protonen durch die Membran nutzen. Damit
gehören die V-ATPasen neben den P- und F-ATPasen zu den Ionentransport-Proteinen, die
einen primär aktiven Transport in der Zelle erzeugen (Pedersen and Carafoli, 1987). Der
durch primären Transport erzeugte Konzentrationsgradient zusammen mit der elektrischen
Spannung entspricht der ionenmotorischen Kraft, die ihrerseits sekundäre Transportprozesse
energetisiert (Harold, 1986). Die eukaryotischen V-ATPasen erzeugen eine protonenmotori-
sche Kraft, mit deren Hilfe H + - und/oder spannungsabhängige Transportprozesse durch
Membranen energetisiert werden können.
Einige wenige Beispiele mögen die Bedeutung von V-ATPasen in intrazellulären
Membranen belegen. So ist die Ankonzentrierung unterschiedlichster Substanzen in sekretori-
schen Organellen wie Chromaffin-Granula, synaptischen Vesikeln oder Mikrovesikeln an die
Energetisierung durch V-ATPasen gekoppelt (Grinstein et al., 1992; Moriyama et al., 1996;
Nelson, 1992). Die durch V-ATPasen energetisierte Ansäuerung in Lysosomen aktiviert saure
Hydrolasen, und beim Akrosom, einem spezialisierten Lysosom in Säugerspermien, wird da-
durch erst die Befruchtung der Eizelle ermöglicht (McLeskey et al., 1998). Auch beim Ab-
wehrsystem von Säugetieren spielen V-ATPasen eine wichtige Rolle, indem sie Phagosomen
ansäuern und damit verschiedene Proteasen und Lipasen, die notwendig für die Bekämpfung
von Infektionen sind, aktivieren (Lukacs et al., 1990; Pitt et al., 1992).
Die Abbildung 1 erläutert die Bedeutung von V-ATPasen in der Plasmamembran am
Beispiel der Energetisierung des Mitteldarmepithels der Raupen von Manduca sexta. Die V-
5

Einleitung
ATPase in der Gobletzell-Apikalmembran erzeugt eine hohe transmembrane Spannung von
mehr als 250 mV. Diese treibt einen elektrophoretischen Austausch von Protonen gegen Kali-
umionen durch einen K + /2H + -Antiporter (Wieczorek et al., 1999). Der K + -
Konzentrationsgradient, zusammen mit der Spannung, führt zur Absorption von Aminosäuren
durch K + -Aminosäure-Antiport in der Apikalmembran der Columnarzellen.
Abb.1 Energetisierung des Mitteldarms von Tabakschwärmerraupen. CCAM, Columnarzell-
Apikalmembran; GCAM, Gobletzell-Apikalmembran; aa, Aminosäure; V, V-ATPase; A, Antiporter; S, Symporter.
Die durch V-ATPasen erzeugte Energetisierung der Plasmamembran spielt nicht nur
bei Insekten eine lebenswichtige Rolle. So sorgen V-ATPasen bei Säugetieren durch den Ab-
bau von Knochensubstanz für den Knochen-Umbau (Blair et al., 1989; Chatterjee et al.,
1992). In Osteoklasten pumpen die in der „gekräuselten“ Membran (ruffled membrane) loka-
lisierten V-ATPasen Protonen in eine am Knochen gelegene Lakune. Die dabei entstehende
Spannung treibt den Transport von Chloridionen durch die in der gleichen Membran lokali-
sierte Cl – -Kanäle. Das auf diese Weise sezernierte HCl baut die anorganische Komponente
der Knochen ab und aktiviert gleichzeitig saure, durch Exocytose in die Lakune gelangte
Hydrolasen, die den Abbau der organischen Komponenten des Knochens katalysieren.
Bei Fröschen und anderen Süßwasser-Tieren energetisieren Plasmamembran-V-
ATPasen die Absorption von Natrium- und Chloridionen in die Haut (Ehrenfeld and Klein,
1997; Klein et al., 1997). Die in der Apikalmembran des Epithels lokalisierten V-ATPasen
pumpen Protonen aus den Zellen in das umgebende Medium und hyperpolarisieren dabei die
Membran. Die entstehende Spannung treibt den Transport der Natriumionen gegen ihren
6

Einleitung
chemischen Gradienten durch amilorid-sensitive Na + -Kanäle aus dem natriumarmem Teich-
wasser in die Epithelzellen, während Chloridionen durch Cl – /HCO3 – -Antiport aufgenommen
werden. Den Transport der Natriumionen aus den Epithelzellen ins Blut übernimmt die baso-
laterale Na + /K + -ATPase.
V-ATPasen spielen auch eine essenzielle Rolle bei der H + -Sekretion in der Säuger-
niere (Bastani and Gluck, 1997; Bastani et al., 1997; Brown et al., 1992). So pumpen die in
der Apikalmembran von Zwischenzellen (intercalated cells) des distalen gewundenen Tubu-
lus und des Sammelrohrs lokalisierten V-ATPasen Protonen aus der Zelle heraus in das Lu-
men. Dies verschiebt das Gleichgewicht der Reaktion: CO2 + H2O ↔ H + + HCO3 – in die
Richtung der Bildung von HCO3 - . Das entstehende HCO3 – wird mittels eines basolateralen
Cl – /HCO3 – -Antiporters in das Interstitium transportiert. Na + -, K + - und Cl – -Kanäle sorgen für
das Gleichgewicht des gesamten Systems.
Weitere Beispiele sind die Ansäuerung des männlichen reproduktiven Traktes, die
notwendig ist für die Reifung der Spermien (Au and Wong, 1980; Levine and Kelly, 1978),
und die Entsäuerung von Makrophagen, die ihnen das Überleben in der sauren Umgebung
von Tumoren ermöglicht (Swallow et al., 1990).
Strukturell bestehen V-ATPasen aus zwei Komplexen, dem peripheren V1-Komplex
und dem membrangebundenen Vo-Komplex (Abb. 2).
Abb.2 Struktur und reversible Dissoziation der V-ATPase.
Die Bezeichnung der Komplexe hat einen historischen Hintergrund und orientiert
sich an der Bezeichnung der Komplexe bei den F-ATPasen (ATP-Synthasen). Beide Protein-
familien weisen eine Reihe struktureller Ähnlichkeiten auf und dürften sich in der Evolution
aus einem gemeinsamen Vorläufer entwickelt haben (Allison et al., 1992; Futai et al., 1994;
7

Einleitung
Pedersen and Amzel, 1993; Penefsky and Cross, 1991; Senior et al., 1992). So entspricht der
V1-Komplex dem F1-Komplex der F-ATPasen, der erstmals als Faktor 1 isoliert worden war.
Genauso verhält es sich mit dem membrangebundenen Vo- und dem Fo-Komplex, wobei letz-
terer seinen Namen wegen der Sensitivität der mitochondrialen F-ATPasen gegen das Antibi-
otikum Oligomycin erhielt (Pedersen and Carafoli, 1987). Der V1-Komplex besitzt eine Mo-
lekularmasse von ca. 500-600 kDa und besteht aus den acht Untereinheiten A, B, C, D, E, F,
G und H. Je drei Kopien der Untereinheiten A und B bilden den sogenannten katalytischen
Kopf der V-ATPase und binden das ATP, wobei für dessen Hydrolyse offensichtlich nur die
Untereinheit A verantwortlich ist (Bowman and Bowman, 1996; Forgac, 1998; Stevens and
Forgac, 1997). Die Aminosäuresequenzen der Untereinheiten A und B sind über 25 % ähnlich
zu den Untereinheiten β und α der F-ATPasen (Nelson and Taiz, 1989). Die anderen Unter-
einheiten des V1-Komplexes weisen keinerlei Sequenzähnlichkeit zu den Untereinheiten der
F-ATPasen auf und liegen wahrscheinlich als einzelne Kopien vor, wobei die v.a. Stöchio-
metrie der Untereinheiten E und G immer noch nicht eindeutig geklärt ist (Arai et al., 1988;
Supekova et al., 1995; Xie, 1996). Funktionell entspricht die V-ATPase Untereinheit D der
γ-Untereinheit der F-ATPasen und bildet mit den restlichen Untereinheiten den sogenannten
Stiel des V1-Komplexes (Arata et al., 2002; Imamura et al., 2003; Xu and Forgac, 2000).
Der ca. 250-300 kDa große Vo-Komplex besteht aus den Untereinheiten a, c, d und e
(Arai et al., 1988; Graham et al., 2003; Jackson and Stevens, 1997; Wieczorek et al.,2003).
Der H + -translozierende Teil besteht aus wahrscheinlich sechs Kopien der Untereinheit c, wo-
bei auch die Isoformen c´ und c´´ beteiligt sein können (Flannery et al., 2004; Gibson et al.,
2002). Die Untereinheit c ist doppelt so groß wie ihr Homolog bei den F-ATPasen und ist of-
fensichtlich durch Gen-Duplikation entstanden (Mandel et al., 1988). So haben die Unterein-
heiten c der V-ATPasen jeweils vier Transmembranregionen und bilden ein Ring, der mit
dem membranständigen c-Teil des Rotors der F-ATPasen vergleichbar ist (Forgac, 1998; Nel-
son, 1992; Noumi et al., 1991). An die Untereinheit c binden Plecomacrolide wie Bafilomycin
und Concanamycin (Huss et al., 2002), hochspezifische Inhibitoren von V-ATPasen
(Bowman et al., 1988; Dröse et al., 1993). Die Funktion der Untereinheit a dürfte die eines
Stators sein, der zusätzlich zum Rotor den Vo-Komplex mit dem V1-Komplex verbindet
(Leng et al., 1999). Hingegen sind die Funktionen der Untereinheiten d und e nicht verstan-
den. Die Untereinheit d kommt offensichtlich bei allen V-ATPasen vor (Stevens and Forgac,
1997), während dies für die zuerst bei Manduca und bei Säugern entdeckte e-Untereinheit
lange Zeit nicht sicher schien (Ludwig et al., 1998; Merzendorfer et al., 1999). Jüngste Be-
8

Einleitung
funde dürften diese Untereinheit allerdings als konstitutive Untereinheit von V-ATPasen aus-
weisen, da sie nunmehr auch bei der Hefe nachgewiesen werden konnte (Sambade and Kane,
2004).
V1- und Vo-Komplex bilden zusammen die funktionelle V-ATPase, die die Hydroly-
se von ATP katalysiert und die Protonen durch die Membran transportiert. Bei Manduca war
ursprünglich nachgewiesen worden, dass während der Häutung der Raupen und beim Hun-
gern der V1-Komplex vom Vo-Komplex dissoziiert (Gräf et al., 1996; Sumner et al., 1995).
Dabei dissoziiert offensichtlich auch die Untereinheit C vom V1-Komplex und beide sind frei
im Zytosol zu finden (Wieczorek et al., 2000). Die Dissoziation, die inzwischen auch für die
ATPasen von Hefen und Säugetieren nachgewiesen wurde (Forgac, 1998; Kane, 1995) und
damit ein allgemeines Charakteristikum für V-ATPasen sein dürfte, ist ein reversibler Pro-
zess; beide Komplexe können wieder reassoziieren, wobei die Anwesenheit der Untereinheit
C aber nicht unbedingt nötig zu sein scheint (Parra and Kane, 1996; Puopolo and Forgac,
1990; Puopolo et al., 1992). Die reversible Dissoziation ist ein sehr effektiver Weg, die V-
ATPase auszuschalten, weil der abgefallene V1-Komplex keine Mg 2+ -ATPase-Aktivität (Hyd-
rolyse von ATP in Anwesenheit von millimolarem Mg 2+ ) besitzt und der membrangebundene
Vo-Komplex auch ohne angedockten V1-Komplex protonendicht ist (Beltran and Nelson,
1992; Gräf et al., 1996). Die im Reagenzglas nachgewiesene Ca 2+ -ATPase-Aktivität (Hydro-
lyse von ATP in Anwesenheit von millimolarem Ca 2+ ) (Gräf et al., 1996; Peng et al., 1993;
Peng et al., 1994; Xie, 1996) ist wegen der submikromolaren Ca 2+ -Konzentration im Zytosol
physiologisch ohne Bedeutung.
Die Aktivität von V-ATPasen wird offensichtlich nicht nur durch die reversible Dis-
soziation, sondern auch auf anderen Ebenen kontrolliert. So kann die Regulation schon bei der
Biosynthese der Untereinheiten beginnen. Bei den Raupen von Manduca wurde nachgewie-
sen, dass die Transkriptionsrate bestimmter Untereinheiten bei der Häutung oder während
Hungerperioden deutlich abnimmt. Offensichtlich spielt die Hämolymph-Konzentration von
20-Hydroxyecdyson, einem Schlüsselhormon bei der Häutung, eine entscheidende Rolle
(Reineke et al., 2002). Erhärtet wird dieser Befund durch das Vorkommen putativer Ecdyson-
regulierbarer Bereiche in den Promotoren der Gene für die Untereinheiten B, G und d. Auch
auf der posttranskriptionellen Ebene könnte die V-ATPase kontrolliert werden, wie der
Nachweis von Antisense-RNA für die Untereinheit d der V-ATPase von Manduca zeigt
(Merzendorfer et al., 1997).
9

Einleitung
Auch auf der Ebene des Proteins gibt es vielfache Möglichkeiten zur Regulation der
V-ATPasen. So können intramolekulare Wechselwirkungen wie das Entstehen von Disul-
fidbrücken, wie es für die Untereinheit A der Rinder-V-ATPase gezeigt wurde (Cysteine in
den Positionen 254 und 532), die Aktivität hemmen (Feng and Forgac, 1992; Feng and For-
gac, 1994). Die Empfindlichkeit gegenüber oxidierenden Bedingungen wurde auch bei V-
ATPasen aus der Hefe und aus Neurospora nachgewiesen (Dschida and Bowman, 1995; Liu
et al., 1997; Taiz et al., 1994). Auch die intramolekulare Kopplung zwischen der ATP-
Hydrolyse und dem Protonentransport ist bei V-ATPasen regulierbar und hängt von ATP-
Konzentrationen und der Hydrolyserate ab (Forgac, 1998; Nelson, 1992). Ein klassisches Bei-
spiel für unterschiedlich starke Kopplungen ist die V-ATPase von Zitronen. So ist die ATPase
in den Vakuolen der Früchte sehr effektiv und produziert einen pH von etwa 2,0, während die
V-ATPase in Vakuolen des Epikotyls dagegen nur einen pH-Wert von 4.0 ermöglicht (Müller
et al., 1997; Müller et al., 1999).
Die Aktivität von V-ATPasen kann auch durch intermolekulare Wechselwirkungen
beeinflusst werden. So wurde gezeigt, dass ein etwa 35 kDa großes Protein aus der Rinder-
Niere und ein 6 kDa großes Protein aus dem Rinder-Gehirn die V-ATPase aktivieren können.
Allerdings ist diese Aktivierung ein pH-abhängiger Prozess und findet nur bei niedrigen pH-
Werten statt (Xie et al., 1993; Zhang et al., 1992a). Ein anderes kleines Protein (6 kDa) aus
der Rinder-Niere hemmt hingegen die V-ATPase (Zhang et al., 1992b).
Letztlich kann die Menge funktionsfähiger V-ATPase in der Membran durch Endo-
zytose bzw. Exozytose von V-ATPase-haltigen Vesikeln reguliert werden. In der Niere von
Säugetieren und in der Krötenharnblase verschmelzen V-ATPase-haltige Vesikel in Abhän-
gigkeit von der zytosolischen Ansäuerung und getriggert über die Konzentration von freiem
Ca 2+ reversibel mit der luminalen Plasmamembran (Albano et al., 1974; Gluck, 1992; Nanda
et al., 1996).
1.2. Aktinfilamente als eine Komponente des Zytoskeletts
Aktinfilamente stellen zusammen mit Mikrotubuli und Intermediärfilamenten das
Zytoskelett von Eukaryoten dar. Durch die Dynamik des Aktin-Zytoskeletts werden lebens-
wichtige Funktionen wie Beweglichkeit, intrazellulärer Transport, Zellform und Zellpolarität,
aber auch Zell-Zell-Interaktionen reguliert. Die Kontraktion von Muskeln bei Tieren beruht
genauso wie die Strömung des Zytoplasmas bei Pflanzen auf der Interaktion von Aktinfila-
10

Einleitung
menten mit Myosin. Durch zahlreiche assozierte Proteine vernetzte Aktinfilamente bilden es-
senzielle Strukturen wie Zell-Cortex und Mikrovilli. Die Beweglichkeit von Makrophagen
und Fibroblasten und damit das Funktionieren des Abwehrsystems und die Regeneration der
Gewebe von Säugetieren kommen durch schnelle und präzise Depolymerisierungs-
Polymerisierungs-Schritte des Aktinzytoskeletts zustande.
Aktin ist ein sehr hoch konserviertes Protein und gehört bei den Eukaryoten zu den
meist verbreiteten Proteinen. Bei verschiedenen Organismen gibt es eine unterschiedliche
Zahl von Aktin codierenden Genen. Die Bäckerhefe besitzt nur ein Aktin-Gen, Menschen ha-
ben sechs Aktin-Gene und Dictyostelium sogar zehn. Beim Aktin unterscheidet man die drei
Isoformen α, β und γ, deren Aminosäuresequenzen mehr als 90% identisch sind. Die höchsten
Unterschiede liegen dabei in den ersten 30 Aminosäuren, was leichte Unterschiede in den
biochemischen Eigenschaften verursacht, die den isoelektrischen Punkt oder die kritische
Konzentration betreffen (siehe unten). Beim Menschen werden α- und γ-Isoformen des Aktins
vor allem in Muskeln produziert, in Nichtmuskel-Geweben dagegen die Isoformen β und γ
(Pollard and Earnshaw, 2002).
Aktinfilamente, die auch als Mikrofilamente bezeichnet werden, haben einen
Durchmesser von etwa 8 nm und bestehen aus Aktin-Monomeren. Monomeres Aktin hat eine
Molmasse von ca. 43 kDa und besitzt eine globuläre Form. Deswegen wird monomeres Aktin
auch G-Aktin genannt, im Gegensatz zum filamentösen F-Aktin. In einem Aktinfilament sind
die benachbarten G-Aktine um etwa 166° gedreht, wobei jedes Monomer mit vier anderen
Monomeren interagiert. Dies führt zu dem Ergebnis, dass die Aktinfilamente im Elektronen-
mikroskop angenähert wie eine doppelsträngige Perlenkette aussehen (Stryer, 1996).
Wenn die Konzentration von G-Aktin einen bestimmten Wert erreicht, beginnen sich
Aktinfilamente zu bilden. Die niedrigste Konzentration, welche die Polymerisierung des Ak-
tin induziert, wird als kritische Konzentration bezeichnet. Sie ist sehr variabel und hängt von
vielen verschiedenen Parametern wie z.B. von zweiwertigen Ionen und Salzen oder auch von
der Temperatur ab. So hat Muskel-Aktin von Säugern bei 4°C in Abweseneit von Mg 2+ und
KCl eine kritische Konzentration von über 3 mg/ml, in Gegenwart von 2 mM Mg 2+ und 50
mM KCl hingegen beginnt das Aktin schon bei einer Konzentration von 0,03 mg/ml zu poly-
merisieren. Auch die Steigerung der Temperatur führt zu einer deutlichen Senkung der kriti-
schen Konzentration. So bildet das Nichtmuskel-Aktin von Säugern bei 30°C die Filamente
schon bei einer Konzentration von etwa 0,03 mg/ml, obwohl dies bei 4°C erst bei einer Kon-
zentration von etwa 0,15 mg/ml passiert (Gordon et al., 1977).
11

Einleitung
Aktin besitzt eine ATPase-Aktivität: es bindet und hydrolysiert ATP sehr langsam zu
ADP und anorganischem Phosphat. Aus diesem Grund unterscheidet man zwischen ATP- und
ADP-Aktin. Die kritische Konzentration für ATP-Aktin ist etwa zehnmal niedriger als für
ADP-Aktin. Aktinfilamente sind polar und haben ein schnell wachsendes „Plus“-Ende, wel-
ches vor allem aus ATP-Aktin besteht und ein langsam wachsendes „Minus“-Ende, das
grundsätzlich aus ADP-Aktin aufgebaut ist (Pollard and Earnshaw, 2002).
In vivo, d.h. in der Zelle, in der bei Säugern die Temperatur und die Salzkonzentrati-
on stabil ist, wird die Dynamik des Aktins durch zahlreiche Aktin-bindende Proteine gesteu-
ert. So werden die Aktinfilamente von der Seite vor allem durch das Tropomyosin stabilisiert,
das an sieben aufeinander folgende Aktin-Monomere bindet (Stryer, 1996). Aktinfilamente
von Skelett-Muskeln werden auch durch ein weiteres Protein, das Nebulin, durch Bindung in
der Längsachse zusätzlich stabilisiert und offensichtlich in ihrer Länge begrenzt (Lukoyanova
et al., 2002).
Eine andere Gruppe von Aktin-bindenden Proteinen, die sogenannten Capping-
Proteine, schützen die Enden der Filamente. Einige wie Fragmin, Gelsolin und CapZ binden
an das „Plus“-Ende, andere wie Tropomodulin können nur mit dem „Minus“-Ende interagie-
ren (Krieger et al., 2002; Schafer and Cooper, 1995); in jedem Fall behindern alle Capping-
Proteine sowohl die Verlängerung als auch die Depolymerisation und regulieren damit die
Länge der Aktinfilamente.
Die Hauptfunktion der zur sogenannten Aktin-Depolymerisations-Faktor
(ADF)/Cofilin-Familie gehörenden Proteine besteht im Zerlegen von Aktinfilamenten bis hin
zu Monomeren. ADF/Cofilin-Proteine binden dabei an Aktinfilamente mit einer Stöchio-
metrie von einem Molekül pro einem F-Aktin-Monomer. Dies führt dazu, dass die „Perlenket-
te“ des Aktinfilaments um etwa 5° stärker verdrillt wird. Die Spannung im Filament führt zur
Spaltung, wobei die Aktinmonomere sich voneinander trennen und das Aktinfilament in die-
sem Bereich vollständig depolymerisiert (Bamburg et al., 1999).
Ein anderes Aktin-bindendes Protein, Profilin, katalysiert den Austausch von ADP
gegen ATP beim ADP-Aktin-Monomer und sorgt durch die Bildung eines ATP-Aktin-Pools
für die Polymerisationsfähigkeit des Aktin-Zytoskeletts (Goldschmidt-Clermont et al., 1992).
Die Wechselwirkung des Aktins mit β-Thymosin, einem anderen G-Aktin-bindenden Protein,
das allerdings nur bei Vertebraten vorkommt, verhindert die Aktin-Polymerisation, was zu ei-
nem G-Aktin-Pool führt; damit reguliert ß-Thymosin ebenfalls die Dynamik des Aktinzy-
toskeletts in der Zelle (Weber et al., 1992).
12

Einleitung
Für das Entstehen und das Funktionieren zellulärer Strukturen wie des Zell-Cortex
oder der Filopodien und Lamellipodien von beweglichen Zellen werden sogenannte Crosslin-
king-Proteine gebraucht. Manche von ihnen binden Aktinfilamente zu parallelen dicken Bün-
deln, andere vernetzen sie quer zueinander und bilden damit maschenähnliche Strukturen.
Manche Crosslinking-Proteine wie z.B. Fimbrin erfüllen ihre Funktion mit Hilfe zweier Ak-
tinbindungsstellen, andere wie z.B. α-Aktinin haben zwar nur eine Aktinbindungsstelle, liegen
aber als Dimere vor (Ayscough, 1998).
Die Aktivität von Aktin-bindenden Proteinen und damit die Dynamik des Aktin-
Zytoskeletts wird vielfältig kontrolliert. Dies zeigt sich besonders bei den Mitgliedern der
Familie der ADF/Cofiline, die sowohl durch Phosphorylierung als auch durch pH-
Änderungen, aber auch durch die Bindung von Polyphosphoinositiden in ihrer Aktivität regu-
liert werden können. So findet die Depolymerisierung der Aktinfilamente nur bei einem pH-
Wert über 7,5 statt, bei einem pH von weniger als 7,5 verlieren die ADF/Cofiline ihre Depo-
lymerisations-Aktivität (Yonezawa et al., 1985). Die Phosphorylierung führt genauso wie die
Bindung von Polyphosphoinositiden zur drastischen Senkung der Affinität zum Aktin
(Ayscough, 1998; Sun et al., 1995). Ein anderes Aktin-bindendes Protein, Gelsolin, welches
Aktinfilamente bricht und neu entstehende „Plus“-Enden stabilisiert, wird in vitro durch Ca 2+
aktiviert und durch Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat gehemmt (Weeds and Maciver,
1993). Beim Profilin schwächt die Interaktion mit Polyphosphoinositiden deutlich die Affini-
tät zum Aktin, während die Phosphorylierung des Profilins die Affinität erhöht (Sathish et al.,
2004; Sun et al., 1995). Crosslinking-Proteine aus der Familie des Fimbrins bzw. des Filamins
besitzen Phosphorylierungsstellen, wodurch vermutlich ihre Wechselwirkung mit dem Aktin-
Zytoskelett reguliert wird (Goldmann, 2001; Messier et al., 1993).
1.3. Wechselwirkung des Aktin-Zytoskeletts mit Transmembranproteinen
Traditionell werden zwei prinzipielle Aspekte der Interaktion zwischen dem Aktin-
Zytoskelett und Membranproteinen diskutiert: die Rolle von Transmembranproteinen bei der
Verankerung des zellulären Cortex an der Membran und der Einfluss der Dynamik des Aktin-
Zytoskeletts auf die Aktivität von Pumpen, Austauschern und Ionenkanälen.
Die Befestigung des Aktin-Zytoskeletts an der Membran wird grundsätzlich durch
zwei Klassen von Transmembranproteinen vermittelt, den Adhäsions-Rezeptoren und den
Ionen-Transportern (Denker and Barber, 2002; Sastry and Burridge, 2000). Die Cadherine
13

Einleitung
und Integrine sind die einzigen Gruppen unter den Adhäsions-Rezeptoren, die mit dem Aktin-
Zytoskelett interagieren. Die Wechselwirkung mit Aktinfilamenten ist dabei indirekt und fin-
det durch die Bindung von verschiedenen sogenannten Adaptor-Proteinen statt. So binden die
intrazelullären Bereiche von Cadherinen zuerst die β-Catenine, die dann über die α-Catenine
mit den Aktinfilamenten interagieren. Die Integrine dagegen binden einen anderen Typ von
Adaptoren, die Taline, die mit Hilfe von Vinculinen mit dem Aktin-Zytoskelett interagieren
(Pollard and Earnshaw, 2002).
Die Wechselwirkung mit dem Aktin-Cortex wurde für alle möglichen Typen von
Ionen-Transportern nachgewiesen. Als Vertreter der Ionenkanäle seien die spannungsabhän-
gigen Na + -Kanäle im Gehirn und die Amilorid-sensitiven Na + -Kanäle in den Mikrovilli-
Membranen von Epithelien genannt (Smith et al., 1995; Srinivasan et al., 1988). Unter den
mit Aktin wechselwirkenden Austauschern befinden sich der Na + /H + -Antiporter, der
Na + /Ca 2+ -Antiporter und die AE1-, AE2- und AE3-Typen der Anionen-Austauscher (Denker
et al., 2000; Jons and Drenckhahn, 1992; Reeves et al., 1996; Denker and Barber, 2002; Jons
and Drenckhahn, 1998). Auch Ionenpumpen wie die Na + /K + - und die H + /K + -ATPasen neh-
men an der Verankerung des Aktin-Zytoskeletts mit der Membran teil (Agnew et al., 1999;
Alper et al., 1994; Festy et al., 2001; Kraemer et al., 2003). Die Interaktion der Ionen-
Transporter mit Aktinfilamenten ist wie bei den Adhäsions-Rezeptoren indirekt und kommt
über verschiedene Adaptor-Proteine zustande. Zu den gut untersuchten Adaptoren gehört das
Ankyrin-Spectrin-System. Spectrin ist an Aktinfilamente fest gebunden und interagiert dabei
mit dem Ankyrin, das wiederum an einen Ionen-Transporter bindet (Bennett and Baines,
2001). Zu einer anderen Klasse von Adaptoren gehören die ERM-Proteine (Ezrin, Radixin
und Moesin) und die Mitglieder der 4.1-Familie (Stabilität der Blutkörperchen), die mit ihrem
aminoterminalen Ende an Transmembranproteine binden, mit ihrem carboxyterminalen Ende
hingegen direkt oder über weitere Adaptoren mit Aktinfilamenten interagieren (Bretscher et
al., 2000; Chishti et al., 1998).
Die Regulation des Ionentransports durch das Aktin-Zytoskelett kann grundsätzlich
auf zweierlei Art und Weise erfolgen. Zum Einen könnten Endozytose-/Exotytose-Prozesse
von Ionentransporter-enthaltenden Vesikeln und damit die Dichte der Ionen-Transporter in
der Membran kontrolliert werden und zum Anderen die eigentliche Regulation ihrer Aktivität.
In beiden Fällen sind die entsprechenden Mechanismen noch nicht gut verstanden.
Die Behandlung mit G-Aktin-bindenden Proteinen wie ß-Thymosin und dem Seg-
ment-1 von Gelsolin in niedrigen Konzentrationen stimulieren die Exozytose in den Acinus-
14

Einleitung
Zellen der exokrinen Drüsen des Pankreas, wie die Senkung der Exozytose-Aktivität nach
Stabilisierung von Aktinfilamenten mit Phalloidin, einem Gift aus Amanita phalloides, zeigte
(Muallem et al., 1995). Dies spricht dafür, dass der Aktin-Cortex als Barriere funktioniert und
die Fusion der Vesikel mit den Membranen reguliert. Auf der anderen Seite verursachen hö-
here Konzentrationen von ß-Thymosin und Gelsolin-Segment-1 eine vollständige Hemmung
der Exozytose. Dies hinweist darauf hin, dass eine gewisse Dichte des Aktin-Cortex für die
Exozytose notwendig ist.
Auch die Endozytose steht unter der Kontrolle des Aktin-Cortex. So wird die Endo-
zytose bei Saccharomyces cerevisiae stark gehemmt, wenn die Gene für Aktin und das Aktin-
bindende Protein Fimbrin ausgeschaltet sind (Kubler and Riezman, 1993). Die Inaktivierung
eines von drei anderen Genen (END3, END5/VRP1 und END7/RVS167) bei der Hefe führt
sowohl zur Zerstörung des Aktin-Zytoskeletts als auch zum Verlust der Fähigkeit zur Endozy-
tose (Benedetti et al., 1994; Munn et al., 1999; Munn et al., 1995). Auch in Zellen von Säuge-
tieren ist die Endozytose an der Dynamik des Aktin-Zytoskeletts gekoppelt (Lamaze et al.,
1997; Muallem et al., 1995).
In letzter Zeit häufen sich Publikationen über den Einfluss von Aktin bzw. Aktin-
bindenden Proteinen auf die Aktivität der Ionentransporter. So wurden die spannungsunab-
hängigen Na + -Kanäle von Leukemia-K562-Zellen durch die Depolymerisierung des Aktins
nach Behandlung mit dem Filament-destabilisierenden Cytochalasin, einem Inhaltsstoff aus
Zygosporium mansonii, oder mit Gelsolin aktiviert (Negulyaev et al., 2000). Die Interaktion
der Na + /K + -ATPase mit Cofilin führt zur Steigerung ihrer Aktivität bis zu über 30 % (Lee et
al., 2001). Interessant dabei erscheint die Tatsache, dass die Na + /K + -ATPase nur die phospho-
rylierte Form des Cofilins bindet, während Aktin nur mit unhosphoryliertem Cofilin interagie-
ren kann (Ayscough, 1998; Jung et al., 2002). Die Depolymerisierung der Aktinfilamente mit
Hilfe von Cytochalasin aktiviert die Cl - -Kanäle in den Zellen des Sammelrohrs der Säugernie-
re; die Stabilisierung des Aktin-Zytoskeletts durch Phalloidin führt dagegen zur Hemmung
der Kanalfunktion (Schwiebert et al., 1994). Auch der Na + /K + /2Cl - -Symporter wird durch
Stabilisierung der Aktinfilamente mit Phalloidin gehemmt, während die Destabilisierung des
Aktin-Zytoskeletts mit Cytochalasin zur Aktivierung des Ionentransports führt (Matthews et
al., 1997).
Diese einzelnen Beispiele zeigen, dass die Wechselwirkung des Aktin-Zytoskeletts
mit Transmembranproteinen, vor allem mit Ionentransportern, sehr kompliziert und oft kaum
verstanden ist. Dabei gibt es nur einen einzigen Punkt, der unumstritten war: die Interaktion
15

Einleitung
zwischen Transmembranproteinen und Aktinfilamenten ist indirekt und findet über verschie-
dene Adaptor-Proteine statt.
Vor einigen Jahren wurde zum ersten Mal eine direkte Interaktion zwischen einem
Ionentransporter und dem Aktin-Zytoskelett beschrieben. Es handelte sich um die V-ATPase
aus Osteoklasten von Säugetieren (Lee et al., 1999). Die immunmarkierte V-ATPase und mit
FITC-Phalloidin markiertes F-Aktin zeigten dabei eine dynamische und vom Entwicklungs-
zustand abhängige Co-Lokalisation in Mäusen-Osteoklasten. Bei noch nicht aktivierten Zellen
aus dem Knochenmark war die V-ATPase mit dem Aktin im Bereich des Cortex, aber auch
des sogenannten kontraktilen Ringes co-lokalisiert. Nach der Aktivierung der Zellen durch
das Umsetzen auf Knochen-Substrat und zu Beginn des Entstehens der „gekräuselten“ Memb-
ran konzentrierte sich die V-ATPase überwiegend im Bereich des kontraktilen Rings. Bei rei-
fen Osteoklasten war die Co-Lokalisation dagegen kaum zu sehen: der kontraktile Ring setzte
sich ab von der „gekräuselten“ Membran, in der die V-ATPase hoch konzentriert vorlag. Der
Verbleib der V-ATPase in frühen Stadien der Osteoklasten auch nach der Behandlung mit De-
tergenzien wie Triton X-100, wobei nur Aktinfilamente und mit ihnen assozierte Proteine
nicht in Lösung gehen, wies auf eine direkte Wechselwirkung hin. Dies wurde auch durch die
Co-Immunpräzipitation mit Antikörpern für die V-ATPase Untereinheit E bestätigt. Einen
endgültigen Beweis für eine direkte Bindung lieferten Co-Sedimentierungsexperimente, ein
Standard-Verfahren für die unmittelbare Interaktion mit Aktinfilamenten, wobei die aus Rin-
der-Nieren gereinigte V-ATPase zusammen mit Aktinfilamenten co-pelletierte. Die dabei be-
rechnete Stöchiometrie ergab eine V-ATPase pro acht F-Aktin-Monomere und eine Dissozia-
tionskonstante von etwa 50 nM.
Im Overlayblot der V-ATPase mit F-Aktin erwies sich die Untereinheit B als Ver-
mittler der Interaktion zwischen beiden Proteinen (Holliday et al., 2000). Durch Co-
Sedimentierungsexperimente mit den rekombinanten Hälften der Untereinheit B wurde die
Bindungsstelle der aminoterminalen Hälfte zugeordnet. Sowohl die aminoterminale Hälfte
der V-ATPase Untereinheit B aus der menschlichen Niere wie auch die der Gehirn-Isoform
co-pelletierten mit Aktinfilamenten in einem Verhältnis von 1 zu 1 und zeigten dabei mit Dis-
soziationskonstanten von 130 nM bzw. 190 nM eine relativ hohe Affinität.
Weitere Versuche mit Peptiden schränkten die Bindungsstelle auf eine elf Aminosäu-
ren lange Sequenz ein (Chen et al., 2004). Die Aminosäuren 45-57 der Untereinheit B aus der
Niere und die Aminosäuren 49-61 der Untereinheit B aus dem Gehirn wurden als Profilin-
16

Einleitung
ähnliches Aktin-bindendes Motiv bezeichnet und zeigten sich kompetitiv gegenüber Profilin
in Aktinbindungsexperimenten.
In der vorliegenden Doktorarbeit sollte mit der V-ATPase von Manduca sexta als
Modellobjekt vor allem überprüft werden, ob die Wechselwirkung mit dem Aktin-Zytoskelett
tatsächlich eine generelle Eigenschaft von V-ATPasen ist. Wie schon erwähnt, stellt die direk-
te Interaktion der V-ATPasen mit dem Zytoskelett ein einzigartiges Phänomen für Trans-
membranproteine dar. Das Verständnis der entsprechenden Mechanismen und der biologi-
schen Funktion dieser Wechselwirkung ist sowohl von der Seite der V-ATPase-Forschung als
auch von der Seite der Regulation der Dynamik des Aktin-Zytoskeletts von großem Interesse.
17

2. Material
2.1. Chemikalien, Enzyme und Antikörper
Alle Chemikalien hatten, sofern nicht anderes erwähnt, p.a. Qualität.
Amresco: Acrylamid (40 %)
Aventis: Mowiol
Biomol: Pefabloc SC
Material
Dianova: Cy3-konjugiertes Anti-Meerschweinchen IgG (106-165-003)
Fluka: Ammoniummolybdat, Essigsäure, Ethanol, Ethanolamin, Gly-
cin, Glukose, Salzsäure (37%), iso-Propanol, Methanol, MgCl2
x 6 H2O, MES, MOPS, 7-Chloro-4-nitrobenzeno-2-oxa-1,3-
diazol-chlorid, Na-EGTA, NaCl, Natriumthiosulfat, Nickelsul-
fat, Saccharose, SDS, Silbernitrat, TCA, TEMED
Gibco: Agar, Agarose (ultrapure), LB-Broth
Grüssing: Formaldehyd (37 %)
Jung: Einbettmedium für Gefrierschnitte
Loewe: IPTG, Tris
Merck: Amidoschwarz, Coomassie Brilliant-Blue R-250, Kaliumhexa-
cyanoferrat (III), Triton X-100
New England Biolabs: Restriktionsenzyme, T4-DNA-Ligase
Rerkin Elmer: Taq-Polymerase
Riedel-de Haen: Aceton, CaCl2 x 2H2O, DMSO, KCl, Natriumazid
Roth: Tween 20
Serva: APS, BCIP, Bromphenolblau, BSA, Ethidiumbromid, Harnstoff,
Na-EDTA, Fischgelatine (flüssig), Natriumacetat, Natriumcar-
bonat, NBT, iso-Pentan
19

Material
Sigma: Anti-α-sarcomeric Aktin monoklonale Antikörper (A 2172),
2.2. Medien und Puffer
Anti-Aktin polyklonale Antikörper (A 5060), Alkalische
Phosphatase-konjugierte Anti-Maus IgG (A 3562), Alkalische
Phosphatase-konjugierte Anti-Kaninchen IgG (A 3687), Alkali-
sche Phosphatase-konjugierte Anti-Meerschweinchen IgG (A
5062), Ampicillin, Bisacrylamid, 2ß-Mercaptoethanol, Cy3-
konjugierte Anti-Maus IgG (C 2181), Cy3-konjugierte Anti-
Kaninchen IgG (C 2306), C12E10, DTT, EDTA (freie Säure),
Glukoseoxidase, Imidazol, Katalase, Mineralöl, Na2-ATP, N-
Ethylmaleimid, Ponceau S, Phalloidin, Phalloidin-FITC, kataly-
tische Untereinheit der Proteinkinase A
Ψb-Medium: 5 g Hefeextrakt, 20 g Pepton 140, 5 g MgSO4 pro Liter, pH 7,6
(mit KOH eingestellt)
Ψa-Medium: entspricht Ψb-Medium und 14 g/l Agar
Amidoschwarz: 2,6 mg/ml Amidoschwarz in Essigsäure/Methanol (1:10)
AP-Puffer: 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9,5
BCIP: 50mg/ml 5-Bromo-4-Chloroindoxylphosphat in reinem Di-
methylformamid
Blockpuffer: 3 % Gelatine in TTBSN-Puffer
Detektionspuffer: 45 µl NBT und 35 µl BCIP pro 10 ml APP-Puffer
ET: 5 mM Na2-EDTA, 5 mM Tris-HCl, pH 8,1
Farmers Reducer: 32 mM Natriumthiosulfat und 30 mM Kaliumhexacyanoferrat
(III)
Fluoreszenz-Puffer: 2 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,1 M
DTT, 20 µg/ml Katalase, 0,1 mg/ml Glukoseoxidase und 3
mg/ml Glukose
20

Material
F-Puffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM Na2-ATP,
pH 7,5
G-Puffer: 2 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 mM CaCl2, 0,2 mM Na2-ATP, 0,5
mM ß-Mercaptoethanol
Lawdowsky-Fixans: Ethanol:Formalin:Essigsäure:Wasser (50:10:4:40)
Lämmli-Puffer: 125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Saccharose, 2% SDS, 0.005%
Bromphenolblau
LO-Puffer: 20 mM Tris-HCl, 50mM NaCl, pH 8,1
LOM-Puffer: 9,6 mM ß-Mercaptoethanol in LO-Puffer
LOMC-Puffer: 0,01% C12E10 in LOM-Puffer
MENT-Puffer: 0,3 M Mannit, 5 mM Na-EDTA, 50 mM NaCl, 17 mM Tris-
HCl, pH 7,5
MENTP-Puffer: 5 mM Pefabloc SC in MENT-Puffer
NBT: 75 mg/ml Nitroblau Tetrazolium in 70 % Dimethylformamid
IBW-Puffer: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA und 1 % Triton X-100
PBS-Puffer: 0.02 M Natriumphosphat, 0.15 M NaCl, pH 7,4
PBS-Blockpuffer: PBS-Puffer mit 2 % BSA und 0,1 % Triton X-100
PLP-Lösung: 0,1 M Sorensen Phosphatpuffer (pH 7,4), 0,1 M Natrium meta-
SET-Puffer: 0,25 M Saccharose in ET
Periodat, 75 mM L-Lysin, 2 % (wt/vol) para-Formaldehyd
SETP-Puffer: 5 mM Pefabloc SC in SET-Puffer
TAE-Puffer: 40 mM Tris-Acetat, 1 mM Na-EDTA, pH 8,3
TE-Puffer: 16 mM Tris-HCl, 0,32 mM EDTA, pH 8,1
TEKP-Puffer: 0,2 M KCl, 5 mM Pefabloc SC in TE-Puffer
TEM-Puffer: 9,6 mM ß-Mercaptoethanol in TE
TTBSN-Puffer: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,5 M NaCl, 0,05% Tween 20 und
0,02% NaN3
21

Material
Transferpuffer: 25 mM Tris, 20 mM Glycine, 20 % (v/v) Methanol
Verdünnungspuffer: 1 % Gelatine in TTBSN-Puffer
2.3. Versuchstiere
Für die Experimente wurden Raupen des Tabakschwärmers Manduca sexta (Lepi-
doptera, Sphingidae) verwendet. Die Raupen wurden in einem Laborbrutschrank bei 27°C
und 16 h Langtag-Bedingungen gehalten und mit semi-synthetischem Futter, verändert nach
Bell & Joachim (1974), ernährt.
22

3. Methoden
3.1. Biochemische und zellbiologische Methoden
3.1.1 Immunfärbung der Gefrierschnitte nach Klein et al. (1991)
Methoden
Der Mitteldarm wurde aus Manduca herauspräpariert, in etwa 5 mm lange Stücke
geschnitten (im Fall des zweiten Larvenstadiums wurden ganze Därme verwendet) und ent-
weder in PLP-Lösung oder aber in Lawdowsky-Fixans 90 Minuten bei Raumtemperatur fi-
xiert. Nach dreimaligem Waschen (je 10 Minuten) in PBS-Puffer wurden die Gewebe zuerst
zweimal 10 Minuten mit 10 % und weitere 15 Minuten mit 20 % Saccharose in PBS-Puffer
bei Raumtemperatur inkubiert. Die darauf folgende Inkubation in 30 % Saccharose wurde
über Nacht bei 4°C durchgeführt. Die Gewebe wurden dann in einen Tropfen des Einbettme-
diums überführt und in mit flüssigem Stickstoff gekühlten iso-Pentan eingefroren. 30 µm oder
10 µm dicke Gefrierschnitte mit dem Gefriermikrotom CM 1900 (Leica) wurden durch zehn-
minütiges Erhitzen bei 60°C auf Superfrost Plus-Objektträgern (Menze-Gläser) fest fixiert.
Die Immunfärbung startete mit einstündiger Inkubation in PBS-Blockpuffer, um un-
spezifische Bindungsstellen abzusättigen. Danach wurden die Schnitte mit einem der in Ta-
belle I aufgelisteten primären Antikörper in PBS-Blockpuffer 1 Stunde lang bei Raumtempe-
ratur behandelt.
Tab.1 Verwendete primäre Antikörper
Primäre Antikörper Bemerkungen Verdünnung
gegen Untereinheit A monoklonal, Klon 221-9, Maus 1:10
gegen Untereinheit C polyklonal, monospezifisch (488-1); Meerschweinchen 1:2.000
gegen Untereinheit d polyklonal, monospezisch, (813-3); Meerschweinchen 1:1.000
Nach dreimaligem Waschen in PBS-Puffer (je 5 Minuten) wurden die Schnitte mit
entsprechenden Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten (Cy3 bzw. TRITC) sekundären Antikörpern
in PBS-Blockpuffer (Verdünnung 1:1.000) 1 Stunde inkubiert. Dann folgte dreimaliges Wa-
schen (je 5 Minuten) in PBS-Puffer und schließlich Einbetten in Mowiol. Die Schnitte wurden
in einem Fluoreszenz-Mikroskop (Olympus IX 70) mit SWG-Filter oder in einem konfokalen
Laser-Scanning Mikroskop (Zeiss, LSM 410) bei λex=568 nm und λem=595 nm analysiert.
23

Methoden
Aktinfilamente wurden mittels FITC-Phalloidin visualisiert. Dafür wurden die
Schnitte zuerst wie beschrieben geblockt und dann mit 160 nM FITC-Phalloidin 40 Minuten
bei Raumtemperatur in PBS-Blockpuffer inkubiert. Nach dreimaligem Waschen (je 5 Minu-
ten) in PBS-Puffer und dem Einbetten in Mowiol wurden die Schnitte im Fluoreszenz-
Mikroskop mit NIBA-Filter oder im konfokalen Laser-Scanning Mikroskop bei λex=488 nm
und λem=515 nm analysiert.
3.1.2. Präparation des V1Vo-Holoenzyms
Die Reinigung des V1Vo-Holoenzyms aus Rohhomogenat von ganzem Mitteldarm
erfolgte nach einem in der Arbeitsgruppe etablierten Protokoll (Huss, 2001; Huss et al.,
2002), das es ermöglicht, etwa 1 mg reines Protein aus 20 Raupen des fünften Larvenstadiums
zu isolieren.
Dafür wurden die herauspräparierten Därme zuerst in kaltem SETP mit einem Ultra-
turrax (IKA, Deutschland) 30 s bei 20.500 rpm homogenisiert. Nach einer Zentrifugation von
5 Minuten bei 10.000 x g und 4°C (JA 25.50, Beckman) wurde das Pellet in SETP resuspen-
diert und wieder unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert. Erneut wurde das Pellet in
SETP-Puffer resuspendiert und schließlich 30 Minuten bei 200.000 x g und 4°C (90 Ti,
Beckman) sedimentiert. Danach wurde das Pellet in TEM-Puffer mit 0,1 % C12E10 bei 4°C so-
lubilisiert und 1 Stunde bei 200.000 x g und 4°C (90 Ti, Beckman) zentrifugiert. Der Über-
stand wurde durch eine Membran mit einer Porengröße von 0,22 µm filtriert und durch Ultra-
filtration in einer Rührzelle (10 kDa Ausschlussgröße, Amicon) unter Druck ankonzentriert.
Das Konzentrat von maximal 4 Därmen wurde auf jeweils einen diskontinuierlichen Saccha-
rosegradienten (3 ml 40 %, 2 ml 30 %, 2 ml 20 % und 1,6 ml 10 % Saccharose (wt/vol) in
TEM-Puffer mit 0,01 % C12E10 und 0,2 M KCl) aufgetragen. Nach einer Zentrifugation von
90 Minuten bei 310.000 x g und 4°C (VTi 65.1, Beckman) wurden die 30 %-Fraktionen etwa
vierfach mit LOMC-Puffer verdünnt und auf eine Anionenaustauscher-Säule (Hyper D Q
Säule, Biosepra) aufgetragen. In einem linearen Gradienten von 50 bis 400 mM NaCl in
LOMC-Puffer eluierte das Holoenzym zwischen 230 und 280 mM NaCl. Die gewünschten
Fraktionen wurden zusammengemischt und mit einem Zentrifugalkonzentrator (100 kDa
Ausschlussgröße, Centricon) auf 100 µl ankonzentriert. Das Konzentrat wurde auf eine Gel-
permeations-Säule (Superdex 200, Amersham-Pharmacia Biotechnology Inc.) aufgetragen
und das V1Vo-Holoenzym in LOMC-Puffer mit 150 mM NaCl endgültig chromatographisch
gereinigt.
24

3.1.3. Präparation des V1-Komplexes
Methoden
Der V1-Komplex wurde nach Gräf et al. (1996) mit Modifikationen isoliert. Um die
Ausbeute von etwa 2 mg pro 20 Mitteldärmen zu erreichen, wurden Raupen des fünften Lar-
venstadiums etwa 12 Stunden vor der Präparation auf Hunger gesetzt. Dies führte zur Tren-
nung des V1-Komplexes vom membrangebundenen Vo-Komplex und damit zu dessen Anrei-
cherung im Zytosol. Die isolierten Därme wurden in kaltem MENTP-Puffer mit einem Ultra-
turrax bei 20.500 rpm 50 s homogenisiert. Nach fünfminütiger Zentrifugation bei 10.000 x g
und 4°C (JA 25.50, Beckman) wurde der Überstand weitere 30 Minuten bei 200.000 x g und
4°C (90 Ti, Beckman) zentrifugiert. Der nun erhaltene Überstand wurde durch eine Membran
mit einer Porengröße von 0,22 µm filtriert, mit dem gleichen Volumen einer eiskalten gesät-
tigten Ammoniumsulfatlösung langsam gemischt und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Das Prä-
zipitat wurde durch Zentrifugation (5 Minuten bei 10.000 x g und 4°C, JA 25.50, Beckman)
gesammelt und in TEM-Puffer mit 0,2 M NaCl gelöst. Nach Auftragen auf einen diskontinu-
ierlichen Saccharosegradienten (3 ml 40 %, 2 ml 30 %, 2 ml 20 % und 1,6 ml 10 % Saccharo-
se (wt/vol) in TEM-Puffer mit 0,2 M NaCl; höchstens 4 Därme pro Gradient) wurde dieser 90
Minuten bei 310.000 x g und 4°C (VTi 65.1, Beckman) zentrifugiert. Die 30 %-Fraktion und
1 ml der unteren 20 %-Fraktion wurden zusammengemischt, mit LOM-Puffer verdünnt und
auf einen Anionenaustauscher (Mono Q Säule, Pharmacia) aufgetragen. In einem linearen
Gradienten von 50 bis 400 mM NaCl in LOM-Puffer eluierte der V1-Komplex bei etwa 220
mM NaCl. Die den V1-Komplex enthaltenden Fraktionen wurden mit einem Zentrifugalkon-
zentrator (100 kDa Ausschlussgröße, Centricon) auf 100 µl ankonzentriert und der V1-
Komplex mittels FPLC (Superdex 200 Säule, Amersham-Pharmacia Biotechnology Inc.) in
LOM-Puffer mit 150 mM NaCl gereinigt.
3.1.4. Reinigung der rekombinanten Untereinheit C mittels einer Ni-NTA-Säule
Die Reinigung des rekombinanten Proteins mittels einer Ni-NTA-Säule erfolgte nach
dem vom Hersteller (Novagen) vorgegebenen Protokoll mit einem zusätzlichem Waschschritt
mit 0,1 M Imidazol und der Elution mit 0,3 M Imidazol in 20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, pH
7,9. Um das von der Säule abgelöste Nickel zu komplexieren, wurde Na-EDTA bis zu einer
Endkonzentration von 10 mM den Fraktionen zugegeben. Schließlich wurden die gewünsch-
ten Fraktionen gegen einen Arbeitspuffer umgepuffert.
25

Methoden
3.1.5. Reinigung rekombinanter Proteine aus Inclusionbodies
Die Reinigung aus Inclusionbodies folgte dem Protokoll von Novagen mit eigenen
Modifikationen und einer Gelchromatographie am Ende. Dabei wurden die Bakterien nach
zweiminütiger Ultrabeschallung (Branson Sonifier, Mikrotip, Stufe 6, 50 % Impulsdauer) zu-
erst 10 Minuten bei 10.000 x g und 4°C (JA 25.50, Beckman) zentrifugiert. Das Pellet wurde
durch Resuspendieren in IBW-Puffer und nachfolgender zehnminütiger Zentrifugation bei
10.000 x g und 4°C dreimal gewaschen. Danach wurden die Inclusionbodies in 20 mM Tris-
HCl (pH 8,1), 6 M Harnstoff, 0,1 % NLS und 1 mM DTT resuspendiert, 15 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert und schließlich 10 Minuten bei 10.000 x g zentrifugiert. Aus dem
resultierenden Überstand wurde das rekombinante Protein mittels einer FLPC (Superdex 75
Präparativ, Pharmacia) im gleichen Puffer weiter gereinigt. Die gewünschten Fraktionen wur-
den in flüssigem Stickstoff eingefroren, bei -70 °C gelagert und bei Bedarf gegen einen Ar-
beitspuffer bei 4°C über Nacht dialysiert.
3.1.6. Präparation des Aktins aus Kaninchenmuskel nach Pardee & Spudich (1982)
Für die in den Abbildungen 4-8 und 12 geschilderten Versuche wurde Aktin verwen-
det, das von Cytoskeleton bezogen worden war. Alle anderen Versuche wurden mit selbst iso-
liertem Aktin (Pardee and Spudich, 1982) durchgeführt. Für die Reinigung des Aktins wurden
etwa 350 g Muskel von den Hinterläufen eines frischgeschlachteten Kaninchens (Charles Ri-
ver) verwendet. Die Muskeln wurden zunächst mit eiskaltem Wasser gewaschen und mit ei-
nem Fleischwolf bei 4°C relativ grob homogenisiert. Das Homogenat wurde 10 Minuten in 1
Liter eiskaltem 0,1 M KCl und 0,15 M Kaliumphosphat pH 6,5 extrahiert und dann mit drei-
schichtigen sterilen Babywindeln nahezu trocken gepresst. Nach weiterer zehnminütiger In-
kubation in 2 Liter 0,05 M NaHCO3 wurde das Homogenat wiederum mit Windeln fast tro-
cken gepresst. Nach zehnminütiger Extraktion mit 1 Liter 1 mM EDTA wurde das Homoge-
nat zweimal mit je 2 Liter H2O 5 Minuten gewaschen. Alle obengenannten Schritte wurden
mit eiskalten Lösungen und bei 4°C durchgeführt. Die nächsten fünf Extraktionen (mit je 1
Liter Aceton und jeweils für 10 Minuten) liefen bei 20-25°C ab. Das entstehende sogenannte
Acetonpulver wurde nach vollständigem Austrocknen bei -70°C gelagert. Zur Reinigung des
Aktins wurde das Acetonpulver zweimal hintereinander je 30 Minuten in G-Puffer mit 0,005
% Azid (2 x 20 ml pro g Acetonpulver) bei 0°C extrahiert und durch eine Windel filtriert.
Beide Filtrate wurden gemischt und durch einstündige Zentrifugation bei 20.000 x g und 4°C
26

Methoden
von Teilchen befreit. Durch Zugabe von zehnfach konzentriertem F-Puffer wurde die Polyme-
risation des Aktins gestartet und 2 Stunden bei 4°C weitergeführt. Danach wurden KCl-
Kristalle bis 0,6 M KCl langsam dazu gegeben und 30 Minuten bei 4°C inkubiert, um Tropo-
myosin von den Aktinfilamenten zu entfernen. Die Aktinfilamente wurden durch zweistündi-
ge Sedimentation bei 200.000 x g und 4°C gesammelt, in 3 ml kaltem G-Puffer mit Azid pro
1 g Ausgangs-Acetonpulver resuspendiert und gegen G-Puffer/Azid bei 4°C drei Tage dialy-
siert. Nach zweistündiger Zentrifugation bei 200.000 x g und 4°C wurde der das G-Aktin ent-
haltende Überstand aliquotiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C gelagert.
Auch nach einer Lagerzeit von 6 Monaten war Aktin immer noch zu 100 % polymerisations-
fähig.
Die Reinheit wurde per SDS-PAGE und Silber-Färbung überprüft; bei bis zu 50 µg
pro Geltasche aufgetragenem Aktin wurde in einem 17 % SDS-Gel keine zusätzliche Bande
detektiert. Falls das Aktin doch Verunreinigungen enthielt, wurden zusätzliche Polymerisati-
ons-Depolymerisations-Schritte durchgeführt.
3.1.7. Co-Pelletierung mit Aktinfilamenten
Diese Methode beruht auf der Eigenschaft von Aktinfilamenten, nach einstündiger
Zentrifugation bei mindestens 100.000 x g, im Gegensatz zu nichtpolymeren löslichen Protei-
nen, zu pelletieren (Wegner and Engel, 1975).
Das Kaninchenmuskel-Aktin wurde in H2O gelöst und 30 Minuten bei 0°C depoly-
merisiert. Nach 30-minütiger Zentrifugation bei 200.000 x g und 4°C wurde das resultierende
G-Aktin (70 µM) durch Zugabe von zehnfach konzentriertem F-Puffer 1 Stunde bei 30°C po-
lymerisiert. Danach wurden die Aktinfilamente mit 10 µM Phalloidin 15 Minuten inkubiert
und dadurch stabilisiert. F-Aktin (0,2 µM) wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen
V1Vo-Holoenzym, V1-Komplex oder rekombinanter Untereinheit C in F-Puffer mit 10 µM
Phalloidin und 2 mM DTT (im Falle des Holoenzyms auch mit 0,01 % C12E10) 2 Stunden bei
Raumtemperatur inkubiert. Nach einstündiger Zentrifugation bei 200.000 x g und 20°C wur-
den die Pellets und Überstände mittels Proteinbestimmung, SDS-PAGE und Silberfärbung
analysiert.
3.1.8. Proteinbestimmung
Die Proteinbestimmung mit Amidoschwarz ist eine hochsensitive, gegen Detergen-
zien und Reduktionsmittel relativ wenig störanfällige photometrische Methode, die auf der
27

Methoden
Eigenschaft des Amidoschwarz, an basische Aminosäuren zu binden, beruht (Wieczorek et
al., 1990). Die Proben wurden zuerst mit 0,3 ml Amidoschwarzlösung 5 Minuten bei Raum-
temperatur inkubiert und danach 4 Minuten bei 16.000 x g (Eppendorf-Tischzentrifuge)
zentrifugiert. Das Pellet wurde durch Vortexen in 0,5 ml Essigsäure/Methanol (1:10) und
nachfolgender Zentrifugation zweimal gewaschen und schließlich in 0,35 ml 0,1 N NaOH ge-
löst. Die Absorption wurde bei 615 nm gemessen. Die Proteinmenge wurde mit einer gleich-
zeitig erstellten Eichreihe für BSA (2, 4 und 6 µg) bestimmt.
3.1.9. SDS-PAGE
Die diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) nach
Laemmli (1970) wurde in vertikalen Gelkammern (BIORAD, Biometra) durchgeführt. Prote-
inproben wurden in Laemmli-Puffer mit 2 % ß-Mercaptoethanol in der Regel 45 Sekunden
bei 100°C erhitzt und auf Eis abgekühlt. Sie wurden sofort auf ein Gel geladen oder bei -20°C
gelagert. Die Sammelgele bestanden aus 5,4 % T/2,3 % C Acrylamid, 0,2 % SDS in 125 mM
Tris-HCl, pH 6,8 und die Trenngele aus 17 % T/0,4 % C Acrylamid, 0,1 % SDS in 330 mM
Tris-HCl, pH 8,7. Die Elektrophorese wurde im Laufpuffer, der 0,1 M Tris, 0,1 M Glycin, 0,1
% SDS, pH 8,8 enthielt, mit einer konstanten Stromstärke von 15mA/Gel für ein Sammelgel
und von 35 mA/Gel für ein Trenngel durchgeführt.
3.1.10. SDS-Gel-Färbung mit Coomassie
Die SDS-Gele wurden nach Bollag und Edelstein (1991) mindestens 30 Minuten bei
Raumtemperatur in Coomassie-Lösung (0,25 % Coomassie Brilliant-Blue R-250 w/v, 50 %
Methanol und 10 % Essigsäure) fixiert und gefärbt. In der Regel wurden die Gele durch das
Kochen in Wasser in einer Haushaltsmikrowelle entfärbt. Beim Arbeiten mit radioaktivem
ATP wurden die Gele 30 Minuten in Entfärber I und danach 1 Stunde in Entfärber II entfärbt.
3.1.11. SDS-Gel-Färbung mit Silbernitrat
Um geringe Proteinmengen in den SDS-Gelen zu visualisieren, wurde die Silberfär-
bung nach Damerval (1994) durchgeführt. Nach SDS-PAGE wurden die Gele mindestens 15
Minuten in 50 % Methanol und 10 % Essigsäure fixiert und anschließend 2 Minuten mit Far-
mers`s Reducer behandelt. Nach mehrmaligem Waschen in H2O und vollständigem Entfernen
des Reducers wurden die Gele in 0,01 % wässrigem AgNO3 15 Minuten inkubiert. Danach
28

Methoden
folgten ein zweifaches Abspülen mit Wasser und die Äquilibrierung mit 2,5 % Natriumkar-
bonat. Die Färbung wurde in 0,16 % (v/v) Formaldehyd und 2,5 % Natriumkarbonat entwi-
ckelt und durch Zugabe von 10 % Essigsäure gestoppt.
3.1.12. Western Blot
Der Western Blot nach Towbin et al. (1979) im Semidry-Verfahren (Transblot SD,
BIO-RAD) ermöglicht die Übertragung der in einem SDS-Gel getrennten Proteine auf eine
Blotmembran. Der Transfer wurde auf eine Nitrocellulosemembran im Transferpuffer bei 1
mA/cm 2 Gelfläche eine Stunde lang durchgeführt. Die Übertragung wurde durch reversibles
Färben der Membran mit 0,02 % Ponceau S und durch das Färben des Gels mit Coomassie
Blau R-250 kontrolliert.
3.1.13. Immunfärbung
Nach der Proteinübertragung per Western Blot oder mittels Slotblot-Technik (SRC
60, Schleicher & Schuell) wurde die Blotmembran zuerst eine Stunde bei Raumtemperatur in
Blockpuffer gebadet, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Danach folgte eine
einstündige Inkubation bei Raumtemperatur mit primären Antikörpern in Verdünnungspuffer
und weiteres dreimaligen Waschen (je 5 Minuten) in TTBSN-Puffer.
Tab.2a Verwendete primäre Antikörper
Primäre Antikörper Bemerkungen Verdünnung
gegen Aktin monoklonal (Sigma A-4700), Maus 1:100
gegen Aktin monoclonal, anti α-sarcomeric (Sigma A-2172); Maus 1:250
gegen Aktin polyklonal (Sigma A-5060); Kaninchen 1:200
gegen Untereinheit C monoklonal, Zellüberstand (Klon12C7); Maus 1:20
gegen Untereinheit C polyklonal, monospezifisch (488-1); Meerschweinchen 1:1.000
Mit entsprechenden sekundären Antikörpern, an die alkalische Phosphatase gekop-
pelt war, wurde die Blotmembran ebenfalls 1 Stunde bei Raumtemperatur in Verdünnungs-
puffer inkubiert. Nach weiterem dreimaligen Waschen in TTBSN-Puffer und Äquilibrierung
in AP-Puffer kam es nach Zugabe des Detektion-Puffers zur Farbreaktion.
29

Methoden
Tab.2b. Verwendete sekundäre Antikörper
Sekundäre Antikörper Verdünnung
Alkalische Phosphatase-konjugierte Anti-Maus IgG 1:10.000
Alkalische Phosphatase-konjugierte Anti-Kaninchen IgG 1:10.000
Alkalische Phosphatase-konjugierte Anti-Meerschweinchen IgG 1:30.000
3.1.14. Overlayblot mit G- und F-Aktin
Dieses Verfahren ermöglicht es, schnell und relativ sicher die potenzielle Interaktion
von Proteinen zu überprüfen. Im vorliegenden Fall wurde der erste Interaktionskandidat
(V1Vo-Holoenzym, V1-ATPase oder Untereinheit C) mittels Western Blot-Verfahren oder
Slotblot-Technik auf eine Blotmembran übertragen. Um unspezifische Bindungsstellen zu
blockieren, wurde die Membran 1 Stunde bei Raumtemperatur in Blockpuffer gebadet. Da-
nach folgte eine einstündige Inkubation mit dem zweiten Interaktionskandidaten (2 µM F-
Aktin oder 2 µM G-Aktin) in Verdünnungspuffer. (F-Aktin-Herstellung: 10 µM G-Aktin
wurde durch Zugabe 10-fach konzentrierten F-Puffers 1 Stunde bei Raumtemperatur polyme-
risiert, mit 10 µM Phalloidin 15 Minuten stabilisiert und mit dem Verdünnungspuffer entspre-
chend verdünnt. G-Aktin-Herstellung: 10 µM G-Aktin wurde mit Verdünnungspuffer 4-fach
verdünnt, auf Eis 30 Minuten inkubiert und 1 Stunde bei 100.000 x g und 4°C abzentrifugiert.
Der den G-Aktin enthaltende Überstand wurde nach Bedarf mit dem Verdünnungspuffer wei-
ter verdünnt.) Nach dreimaligem Waschen (je 5 Minuten) der Membran in TTBSN-Puffer
wurde gebundenes Aktin mit einem der anti-Aktin-Antikörper detektiert.
3.1.15. Co-Präzipitation des zytosolischen Aktins mit rekombinanter Untereinheit C
Um zu überprüfen, ob die rekombinante Untereinheit C auch mit dem Aktin aus
Manduca reagiert, wurde eine Co-Präzipitazion durchgeführt. Dafür wurde die rekombinante
Untereinheit C an Affi-Gel 10-Kügelchen (Biorad) kovalent gekoppelt. Die Kopplung erfolgte
nach dem Protokoll des Herstellers und startete mit dem dreimaligen Waschen des Affi-Gels
in eiskaltem Wasser und schließlich der Äquilibrierung in 0,1 M MOPS-NaOH (pH 7,5). 0,2
ml Affi-Gel wurde mit ca. 2 ml Untereinheit C (0,1 mg/ml) in 0,1 M MOPS-NaOH (pH 7,5),
9,6 mM ß-Mercaptoethanol und 0,01 % C12E10 über Nacht bei 4°C und langsamem Rotieren
inkubiert. Nicht gekoppelte Untereinheit C wurde durch Waschen mit MOPS-Puffer entfernt.
30

Methoden
Um die restlichen Estergruppen des Affi-Gels zu deaktivieren, wurde der Ansatz 1 Stunde mit
0,2 ml 1 M Ethanolamin-HCl (pH 8.0) bei 4°C rotiert. Nach dem Herauswaschen des Ethano-
lamins mit TEK-Puffer war die an Affi-Gel gekoppelte Untereinheit C einsatzbereit.
Um zytosolischen Extrakt herzustellen, wurden 5 Mitteldärme des fünften Larven-
stadiums isoliert und in 2 ml TEKP-Puffer mit einem Homogenisator (Wheaton; 7 ml) homo-
genisiert. Nach Entfernung der Zellreste durch zwanzigminütige Zentrifugation bei 20.000 x g
und 4°C wurde der Überstand mit ß-Mercaptoethanol bis zu einer Endkonzentration von 9,6
mM supplementiert und zur Affi-Gel-Untereinheit C zugegeben. Nach zweistündiger Inkuba-
tion bei 4°C und Rotieren wurden die Kügelchen mit MOPS-Puffer mehrmals gründlich ge-
waschen und schließlich in Lämmli-Puffer 1 Minute gekocht. Als Positiv-Kontrolle wurde ein
gleicher Ansatz mit Kaninchenmuskel-Aktin statt zytosolischem Extrakt durchgeführt. Ge-
bundenes Aktin wurde nach SDS-PAGE und Western Blot mit Hilfe polyklonaler anti-Aktin-
Antikörper nachgewiesen.
3.1.16. Reassoziation des V1-Komplexes mit rekombinanter Untereinheit C
Um einen V1-Komplex ohne Untereinheit C herzustellen, wurde als letzter Schritt
der V1-Reinigung eine Gelchromatographie wie bei der Isolierung des V1-Komplexes aus
Mitteldarm (3.1.3.), allerdings in Gegenwart von 25 % Methanol durchgeführt, was zur Ablö-
sung der Untereinheit C führte. 0,1 mg C-freier V1-Komplex wurden mit zehnfachem molaren
Überschuss von rekombinanter Untereinheit C in 20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 150 mM NaCl
und 9,6 mM ß-Mercaptoethanol 16 Stunden bei 4°C inkubiert. Nach Entfernung ungebunde-
ner Untereinheit C durch Gelchromatographie in 20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 150 mM NaCl
und 9,6 mM ß-Mercaptoethanol (Superdex 200, Pharmacia) wurde der V1-KomplexCrec fertig-
gestellt und für die Co-Pelletierung verwendet.
3.1.17. Nachweis der freien Untereinheit C im Zytosol von Manduca
Zuerst wurde die Verteilung der rekombinanten Untereinheit C im Saccharosendich-
tegradienten untersucht. Dabei wurde etwa 1 ml 5 µM Untereinheit Crec in LOM-Puffer auf
einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten (3 ml 40 %, 2 ml 30 %, 2 ml 20 % und 1,6 ml
10 % Saccharose (wt/vol) in TEM-Puffer mit 0,2 M NaCl) aufgetragen und 90 Minuten bei
310.000 x g und 4°C (VTi 65.1, Beckman) zentrifugiert. Dann wurde der Gradient 1 ml-weise
aliquotiert und mittels SDS-PAGE und Coomassie-Färbung analysiert.
31

Methoden
Um zu überprüfen, ob die Untereinheit C im Zytosol auch frei vom V1-Komplex
existiert, wurden 5 Mitteldärme des fünften Larvenstadiums in 3 ml F-Puffer mit 5 mM Pe-
fabloc SC vorsichtig mit einem Glashomogenisator (Wheaton) homogenisiert, um das Aktin-
Zytoskelett zu erhalten. Danach wurde das Homogenat 5 Minuten bei 10.000 x g und 4°C
zentrifugiert, um es von Zellbruchstücken zu befreien, und der Überstand anschließend 1
Stunde bei 200.000 x g und 4°C zentrifugiert, um Aktinfilamente und die das V1Vo-
Holoenzym enthaltende Membranen zu entfernen. Nach der Zugabe von ß-Mercaptoethanol
bis einer Konzentration von 9,6 mM wurde der Überstand auf einen diskontinuierlichen Sac-
charosegradienten (3 ml 40 %, 2 ml 30 %, 2 ml 20 % und 1,6 ml 10 % Saccharose (wt/vol) in
TEM-Puffer mit 0,2 M NaCl) aufgetragen und 90 Minuten bei 310.000 x g und 4°C (VTi
65.1, Beckman) zentrifugiert. Fraktionen, die der Verteilung von Crec entsprachen, wurden zu-
sammengemischt und auf ein SDS-Gel aufgetragen. Als Kontrolle wurden die den V1-
Komplex enthaltenden Fraktionen (3.1.3.) eingesetzt. Nach SDS-PAGE und Western Blot
wurde die Untereinheit C mittels Immunfärbung (3.1.13.) mit einem monoklonalen Antikör-
per detektiert.
3.1.18. Interaktion mit NBD-gekoppeltem G-Aktin
Die Analyse der Wechselwirkung von Proteinen mit NBD-gekoppeltem G-Aktin ist
eine einfache und zuverlässige Methode, vorausgesetzt, die Bindung an G-Aktin führt zu ei-
ner Konformationsänderung, die sich fluorimetrisch erfassen lässt (Carlier et al., 1997; Var-
tiainen et al., 2002). Die Herstellung von NBD (7-Chloro-4-nitrobenzono-2-oxa-1,3-diazol)-
Aktin nach Detmers et al. (1981) startete mit der Kopplung von N-Ethylmaleimid an Lysin
372 des Aktins. Hierzu wurde 45 µM G-Aktin mit 0,5 mM N-Ethylmaleimid (NEM) unter
Aktin-polymerisierenden Bedingungen (5 mM Tris-HCl (pH 8,0), 2 mM MgCl2, 0,1 M KCl
und 0,2 mM DTT) zuerst 15 Minuten bei Raumtemperatur, dann 15 Minuten bei 15°C und
schließlich 2,5 Stunden bei 2°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von DTT bis zu
einer Endkonzentration von 1 mM gestoppt und polymerisiertes NEM-Aktin wurde durch
einstündige Zentrifugation bei 100.000 x g und 4°C pelletiert. Das NEM-Aktin wurde in 10
mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM ATP, 0,1 M KCl und 2 mM MgCl2 re-
suspendiert, bis etwa 1 mg/ml verdünnt und 5 Stunden bei 15°C mit 0,4 mM NBD-Cl inku-
biert. Das entstehende NBD-F-Aktin wurde durch zweistündige Sedimentation bei 100.000 x
g und 4°C pelletiert und danach in G-Puffer resuspendiert. Nach vollständiger Dialyse gegen
G-Puffer und zweistündiger Zentrifugation bei 100.000 x g und 4°C enthielt der Überstand
32

Methoden
NBD-G-Aktin. Mg-ATP-(NBD)-Aktin wurde nach Pollard (1986) durch Inkubation des
NBD-Aktin mit 50 µM MgCl2 und 0,2 mM EGTA hergestellt. Durch vierstündige Inkubation
des Mg-ATP-(NBD)-Aktin mit Hexokinase-Agarose-Kügelchen (Sigma) und 1 mM Glukose
bei 4°C entstand Mg-ADP-(NBD)-Aktin.
NBD-Aktin (0,2 µM) wurde mit verschiedenen Konzentrationen rekombinanter Un-
tereinheit C in 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 40 mM NaCl, 0,2 mM MgCl2, 0,1 mM DTT, 0,5
mg/ml BSA sowie 0,1 mM ATP (bei ATP-Aktin) oder ADP (bei ADP-Aktin) 30 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert. Die NBD-Fluoreszenz wurde bei λex=470 nm und λem=530 nm in
einem Perkin Elmer Lumineszenz Spektrometer LS 50 B gemessen. Die Kd-Werte wurden
nach Vartiainen et al. (2002) berechnet, indem die Fluoreszenzänderungen als Funktion der
Konzentration der Untereinheit C für eine Bindungskurve auf der Basis eines Komplexes mit
einer 1:1-Stöchiometrie angepasst wurden.
3.1.19. Aktin-Depolymerisierung
Mit diesem Ansatz wurde die potenzielle Eigenschaft der Untereinheit C, die Aktin-
filamente zu depolymerisieren, überprüft. Nach der Polymerisation in F-Puffer wurde F-Aktin
durch einstündige Zentrifugation bei 200.000 x g und 20°C gesammelt. Danach wurde es in
einer Konzentration bis zu 3,5 µM in 10 mM Tris-MES (pH 6,0; 7,0; 8,5) resuspendiert und in
Gegenwart von 2 µM Untereinheit C 2 Stunden bei 25°C inkubiert. Als Kontrollen dienten
Ansätze ohne bzw. mit 2 µM Protein (pH 7,0). Nach einstündiger Zentrifugation bei 200.000
x g und 20°C wurden die Überstände mittels SDS-PAGE und Coomassie-Färbung analysiert.
3.1.20 Lichtstreuung
Die Regel, dass die Streuung des Lichts durch ein Teilchen proportional zur Teil-
chengröße ist, diente als Basis für die Messungen zur Untersuchung der Zeitabhängigkeit der
Aktinpolymerisation (Cooper and Pollard, 1982; Kang et al., 1999). Die Polymerisation von
5,7 µM Aktin in Gegenwart von Untereinheit C wurde durch Zugabe zehnfach konzentrierten
F-Puffers gestartet und bei 400 nm unter einem Winkel von 90° mit einem Perkin Elmer Lu-
mineszenz Spektrometer LS 50 B gemessen.
33

Methoden
3.1.21. Pelletierung von gebündeltem Aktin
Um gebündelte Aktinfilamente nachzuweisen, wurde eine Zentrifugation bei 20.000
x g statt 100.000 bis 200.000 x g durchgeführt (Robinson et al., 2002; Fraley et al., 2003;
Kron et al., 1991). Zunächst wurde 10 µM G-Aktin in Gegenwart von 0,4 µM Gelsolin (Cy-
toskeleton) polymerisiert, um gleichmäßig lange Aktinfilamente zu erhalten. Nach Stabilisie-
rung mit 10 µM Phalloidin wurde 0,4 µM F-Aktin mit ca. 0,2 µM Untereinheit C 90 Minuten
bei 4°C inkubiert. Die Pellets und Überstände nach zwanzigminütiger Zentrifugation bei
20.000 x g und 4°C wurden per SDS-PAGE und Silber-Färbung analysiert.
3.1.22. Fluoreszenz-Mikroskopie von Aktinfilamenten
Nach Polymerisierung in F-Puffer und Stabilisierung mit 10 µM FITC-Phalloidin
wurde F-Aktin in einer Konzentration von 6,6 µM mit Fluoreszenz-Puffer (Kron et al., 1991)
1:2 verdünnt und 15 Minuten bei 20.000 x g und 4°C zentrifugiert, um mögliche Aggregate
zu entfernen. 0,2 µM des so vorbereiteten F-Aktins wurde mit 14 µM Untereinheit C in 10
mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,25 mM NaCl, 0,25 mM KCl, 0,5 mM MgCl2, 50 mM DTT, 10
µg/ml Katalase, 0,05 mg/ml Glukose-Oxidase, 1,5 mg/ml Glukose und 0,05 % NLS 30 Minu-
ten bei Raumtemperatur inkubiert. 3µl der Suspension wurden auf Super Frost Plus-
Objektträger (Menzel-Gläser) aufgetragen und fluoreszenzmikroskopisch visualisiert (Olym-
pus IX 70, U-MWIB Filter, 100x Uplan-Apo-Objektiv (NA 1.35)). Als Software diente
Olympus DP-Soft SVI.
3.1.23. Nachweis der Oligomerisierung von rekombinanter Untereinheit C
im Saccharosedichtegradienten
Um zu überprüfen, ob die rekombinante Untereinheit C unter oxidierenden Bedin-
gungen Dimere und/oder Oligomere bildet, wurde eine Zentrifugation im Saccharosedich-
tegradienten, modifiziert nach Vartiainen et al. (2000), durchgeführt. 0,3 ml Untereinheit C in
einer Konzentration von 0,35 mg/ml in LO-Puffer wurden auf einen kontinuierlichen Saccha-
rosegradienten (5 % bis 20 %, wt/vol; in TEK-Puffer) aufgetragen. Als Kontrolle wurden et-
wa 0,6 mg einer Protein-Mischung (Kalibrierungs-Kit von Amersham Biosciences), die Ka-
ninchenmuskel-Phosphorylase b (97kDa), Rinderserumalbumin (66 kDa) und Hühnereiweiß-
Ovalbumin (45 kDa) in 0,3 ml LO-Puffer enthielt, auf einen anderen Gradienten geschichtet.
Nach 3,5-stündiger Zentrifugation bei 310.000 x g und 4°C in einem Vertikalrotor (VTi 65.1,
34

Methoden
Beckman) wurden die Gradienten 0,5 ml-weise fraktioniert und mittels SDS-PAGE und Sil-
berfärbung analysiert.
3.1.24. Phosphoprotein-Färbung im SDS-Gel
Dieses Verfahren nach Cutting & Roth (1973) ermöglicht die Detektion phosphory-
lierter Proteine nach der SDS-PAGE. Grundlage ist dabei die Hydrolyse von Phosphoserin
oder Phosphothreonin und die Bildung eines unlöslichen Phosphomolybdat-Komplexes, wel-
cher mit Methylgrün einen intensiven Farbkomplex bildet. Nach SDS-PAGE und zehnminü-
tigem Waschen in Wasser wurden die Gele 15 Minuten in 10 % Sulfosalicylsäure vorinku-
biert. Es folgte eine Inkubation von 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,5 M CaCl2 in 10 %
Sulfosalicylsäure. Nach kurzem Abwaschen in Wasser wurden die Gele 20 Minuten bei 65°C
in 0,5 N NaOH behandelt. Dann folgte eine zweimalige Äquiliblierung in 1 % Ammonium-
molybdat für jeweils 10 Minuten und eine weitere 20-minütige Inkubation mit 1 % Molybdat
in 1 N HNO3. Nach der 20-minütigen Farbreaktion mit 0,5 % Methylgrün in 7 % Essigsäure
wurde das Gel in 10 % Sulfosalicylsäure bei mehrmaligem Wechsel des Mediums bis zur
adäquaten Farbintensität entfärbt.
3.1.25. Autophosphorylierung
10 µM rekombinante Untereinheit C wurde mit 2 mM ATP (ohne ATP als Kontrolle)
in 20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 50 mM NaCl, 4 mM MgCl2 und 0,1 % NLS ab zwischen 30 Mi-
nuten und 12 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Kochen (45
Sekunden) in Lämmli-Proben-Puffer gestoppt. Auf das SDS-Gel wurden jeweils 10 µg der
Untereinheit C, von Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor als Negativ- und Phosvitin als Positiv-
Kontrolle aufgetragen. Nach SDS-PAGE wurde die Phosphoproteinfärbung im Gel durchge-
führt.
3.1.26. Protein Kinase A-katalysierte Phosphorylierung
12 µg rekombinante Untereinheit C wurden mit 100 Units katalytischer Untereinheit
der Proteinkinase A in 20 mM Hepes (pH 7,5), 0,1 M NaCl, 4 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,1
% NLS, 2 mM ATP und 5 µCi [γ- 32 P]-ATP (Amersham) 3 Stunden bei 30°C inkubiert. Nach
Beenden der Reaktion durch Zugabe von fünffachem Lämmli-Proben-Puffer wurden die Pro-
ben auf ein SDS-Gel aufgetragen. Nach Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie gefärbt
35

Methoden
und schließlich mit Entfärber I und II entfärbt. Das auf Whatmanpapier getrocknete Gel wur-
de 2 Tage auf einem Phosphoscreen exponiert und mit einem Phosphoimager ausgewertet.
3.2. Molekularbiologische Methoden
3.2.1. Polymerase-Kettenreaktion
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde in einem PCR-Gerät der Firma MWG
Biotech (Primus) durchgeführt. Ein 25 µl Standardansatz enthielt 50 mM KCl, 10 mM Tris-
HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl2, 0,01 % Gelatine, je 0,2 mM dNTP, 20 pMol Primer, maximal
0,2 µg Template sowie 0,6 U Taq-Polymerase und wurde mit einem Tropfen Mineralöl über-
schichtet. Die Zugabe der Taq-Polymerase erfolgte stets erst nach einer anfänglichen Denatu-
rierung von 2 Minuten bei 94 °C. Die Annealing-Temperatur wurde nach der empirischen
Formel T=4°C x (G+C)+2°C x (A+T)-3°C berechnet (Lion and Haas, 1990) und war für die
cDNA der N- und C-terminalen Hälften der Untereinheit C 53°C. Der Reaktionszyklus laute-
te: 1 x 2 min 94°C, 40 x (30 s 94°C, 40 s 53°C, 1 min/kb 73°C), 5 min 73°C. Die PCR-
Produkte wurden durch Gelelektrophorese in 0,5 % Agarose getrennt und mit Ethidiumbro-
mid gefärbt.
3.2.2. Agarosegelelektrophorese
Die DNA-Fragmente wurden in 0,5 % Agarosegelen, TAE-Puffersystem und Flach-
bett-Minigelkammern bei 7-10 V/cm elektrophoretisch aufgetrennt. Zur Visualisierung wur-
den die Gele 20 Minuten mit Ethidiumbromid (1 µg/ml in TAE) gefärbt und anschließend 20
Minuten mit Wasser differenziert. Die Dokumentation erfolgte photographisch unter Verwen-
dung eines Transilluminators mit Anregungswellenlänge von 312 nm. Die gewünschten
DNA-Banden wurden ausgeschnitten und die DNA mit dem QIAquick Gel Extraktion-Kit
(Qiagen) isoliert.
3.2.3. Ligation und Transformation
Die 10 µl-Ligationsansätze enthielten 3 Weiss-Units T4-DNA-Ligase, 100 ng Vek-
tor, die 10-fache molare Menge an Insert in 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10
mM DTT, 50 µg/ml BSA und 1 mM ATP. Die Inkubation dauerte mindestens 20 Stunden bei
16°C und wurde durch zehnminütiges Erhitzen bei 72°C beendet. Für die Transformation
36

Methoden
wurden 100 µl Aliquots tiefgefrorener kompetenter Zeller langsam bei Hand-Temperatur auf-
getaut und 10 Minuten auf Eis temperiert. Dann wurden sie mit dem Ligationsansatz gemischt
und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Nach 90-sekündigem Erhitzen bei 42°C und zweiminüti-
gem Abkühlen auf Eis wurde der Ansatz mit 0,8 ml LB-Medium verdünnt und 1 Stunde bei
37°C sanft geschüttelt. Um positiv transformierte Zellen zu erkennen, wurde die Selektion auf
LBAmpicilin/Chloramphenicol Platten durchgeführt.
3.2.4. Herstellung kompetenter Zellen
Nach dem Protokoll von New England Biolabs wurde der Empfängerstamm auf Ψa-
Platten ausplattiert und über Nacht bei 37°C angezüchtet. Davon wurde eine einzelne Kolonie
zum Impfen des 5 ml Ψb-Mediums verwendet und bis zu einer OD550 von 0,4 bei 37°C ge-
schüttelt. Mit dieser Vorkultur wurden weitere 100 ml Ψb-Medium geimpft und bis zu einer
OD550 von etwa 0,5 kultiviert. Nach dem Abkühlen auf Eis wurden die Zellen 5 Minuten bei
5.000 x g und 4°C abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 40 ml eiskaltem Tfb-1 resuspendiert
und 5 Minuten auf Eis inkubiert. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt wurde das Pellet
in 4 ml Tfb-2 resuspendiert. Nach 15 Minuten auf Eis wurden die jetzt schon kompetenten
Zellen in 100 µl-Aliquots in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bei -70°C gelagert.
3.2.5. Herstellung rekombinanter Proteine
Für die Expression der vollständigen Untereinheit C standen transformierte Escheri-
chia coli-Zellen zur Verfügung (Huss, 2001). Das rekombinante Protein wurde mit Hilfe des
pET-Systems von Novagen in Gegenwart von 0.4 mM IPTG 3 Stunden bei 37 °C exprimiert
und entweder über eine Ni-NTA-Säule oder aber als Inclusionbodies gereinigt (siehe 3.1.5.).
Beim Klonieren der N-terminalen (Aminosäurereste 1 bis 194) und C-terminalen
(Aminosäurereste 190 bis 385) Hälften der Untereinheit C wurde das pBluescript SK(-) Plas-
mid, das cDNA für die Untereinheit C von Manduca enthält, als Template für die PCR be-
nuzt. Für die N-terminale Hälfte wurde 5´-TACTCACATATGTCGGAGTACTGGTTGATA-
3´ als Vorwärts-Primer und 5´-TACTCACTCGAGGTTGAACATCGATTTAGGCA-3´ als
Rückwärts-Primer, für die C-terminale Hälfte 5´-TACTCACATATGCCTAAATCGATGT
TCAACGA-3´ als Vorwärts-Primer und 5´-TACTCACTCGAGAGCCGCCTTCTCGATCAT
GT-3´ als Rückwärts-Primer eingesetzt. Die beiden Vorwärts-Primer hatten eine Nde I-
Schnittstelle (unterstrichen) und die beiden Rückwärts-Primer eine Xho I-Schnittstelle (unter-
strichen). Die PCR-Produkte wurden nach den Angaben des Herstellers in pET-23a(+) (No-
37

Methoden
vagen) ligiert. Die rekombinanten Plasmide wurden in E. coli BL21(DE3)/pLysS-Zellen
transformiert und in Gegenwart von 0.4 mM IPTG 3 Stunden bei 37°C exprimiert. Beide re-
kombinanten Proteine wurden nach dem oben erwähnten Protokol aus Inclusionbodies gerei-
nigt.
3.2.6. Injektion von siRNA
Die Sequenz UUUAUAGUUGAGGCUGAGGUU wurde als Antisense für die Un-
tereinheit C aus Manduca ausgesucht (Kriterien: 50-100 nt vom Startkodon; 30% < G/C <
70%). Die Einmaligkeit der ausgesuchten Sequenz wurde anhand der genomischen Sequenzen
von Drosophila melanogaster, die, soweit bekannt, hohe Ähnlichkeiten mit bekannten DNA-
Sequenzen von Manduca besitzen, kontrolliert. Die siRNA wurde von MWG-Biotech bezo-
gen.
Die Raupen, die innerhalb von 5 Stunden schlüpften, wurden alle gleichzeitig auf
Futter gesetzt. Nach weiteren 18 Stunden wurden Raupen, die sich im ersten Larvenstadium
befanden und ein Gewicht von ca. 6 mg hatten, für das Experiment verwendet. Die Menge der
injizierten siRNA basierte auf Angaben für adulte Drosophila (Dzitoyeva et al., 2003), wobei
auf das Körpergewicht der Raupen umgerechnet wurde. Nach 2-3-minütiger Betäubung der
Raupen auf Eis wurden die Analhörner abgeschnitten und die siRNA in die entstandenen Öff-
nungen mit einer zugespitzten Glasselektrode mittels einer Nanoliter-Pumpe (1400 EC, WPI)
eingespritzt. Die Injektion dauerte 1 min und wurde mit einer Geschwindigkeit von 100
nl/min durchgeführt. Als Kontrolle wurde ein entsprechendes Volumen Puffer injiziert.
38

4. Ergebnisse
4.1. Interaktion der V-ATPase aus Manduca mit Aktinfilamenten
4.1.1. Co-Lokalisation der V-ATPase mit Aktinfilamenten
Ergebnisse
Die Prüfung der Frage, ob die V-ATPase in den apikalen Membranen der Gobletzel-
len des Mitteldarms von Tabakschwärmerraupen wie die V-ATPase aus Osteoklasten mit Ak-
tin interagiert, erforderte zunächst die Überprüfung, ob die Plasmamembran-V-ATPase von
Manduca mit Aktinfilamenten co-lokalisiert.
Abb.3 Co-Lokalisierung der V-ATPase mit F-Aktin. 30µm dicke Gefrierschnitte des posterioren Mitteldarms
(A), der Malpighigefäße (C) und der Speicheldrüsen (D) wurden mit FITC-Phalloidin (links) und mit dem
monoklonalen Antikörper 221-9 gegen die Untereinheit A der V-ATPase (rechts) doppelmarkiert (siehe 3.1.1.)
und zur Visualisierung der Co-Lokalisierung optisch übereinandergelegt (Mitte, gelbe Farbe). (B) 30 optische
Schnitte des anterioren Mitteldarms von je 1 µm Dicke wurden nach Doppelmarkierung wie oben übereinandergelegt
und der Overlay tiefencodiert dargestellt (linkes Bild). Um die Co-Lokalisation an der apikalen Gobletzellmembran
(gelbe Farbe) zu verdeutlichen, wurde eine dreidimensionale Repräsentation von 30 1µm-Schnitten
berechnet (rechtes Bild). CCAM, Columnarzell-Apikalmembran (brush border); GCAM, Gobletzell-
Apikalmembran; a, apikal; b, basal. Größenbalken: 50 µm. Das Bild wurde mir von Dr. Hans Merzendorfer
überlassen.
39

Ergebnisse
Wie schon bekannt war und die Immunfärbung (Abb. 3, rechts, A, C und D) bestätig-
te, kommt die V-ATPase in den apikalen Membranen der Malpighi-Gefäße, der Speicheldrü-
sen und der Gobletzellen reichlich vor. Das Gleiche gilt für Aktinfilamente, die zusätzlich
auch in besonders hoher Konzentration in der apikalen Membran der Columnarzellen des Mit-
teldarms vorliegen (Abb. 2, links; A, C und D). Damit war geklärt, dass die V-ATPase und
Aktinfilamente co-lokalisieren, d.h., im konfokalen Mikroskop als zumindest nahe benachbart
identifiziert werden konnten.
4.1.2. Co-Pelletierung des V1Vo-Holoenzyms und des V1-Komplexes mit Aktin
Die Co-Lokalisation der V-ATPase mit Aktinfilamenten lässt sich zwar als Hinweis
auf eine mögliche Interaktion der V-ATPase mit Aktin verstehen, beweist diese Annahme
aber noch nicht. Um eine direkte Bindung der V-ATPase an Aktinfilamente zu testen, wurde
in vitro eine Co-Pelletierung durchgeführt. Hierzu wurde aus Kaninchenmuskel gereinigtes
Aktin verwendet, das 93 % Identität und 98 % Ähnlichkeit zum Aktin von Manduca aufweist.
Das V1Vo-Holoenzym beziehungsweise der V1-Komplex wurde in verschiedenen Konzentra-
tionen mit 0,2 µM Aktin inkubiert und danach bei 200.000 x g 1 Stunde zentrifugiert. Nach
SDS-PAGE und Silber-Färbung fand sich sowohl das V1Vo-Holoenzym (Abb. 4A) als auch
der V1-Komplex (Abb. 4B) in konzentrationsabhängiger Weise im Pellet zusammen mit Ak-
tin. Dies bedeutet, dass die V-ATPase aus Tabakschwärmerraupen direkt an Aktinfilamente
bindet.
Die Proteinbestimmung der Pellets ergab, dass ca. 0,04 µM V1Vo-Holoenzym bzw.
ca. 0,05 µM V1-Komplex mit 0,2 µM Aktin im Sättigungsbereich co-pelletieren (Abb. 4C).
Die daraus folgende Stöchiometrie entspricht damit einer V-ATPase pro 4-5 F-Aktin-
Monomere und passt gut zur bei der Rinder-V-ATPase gefundenen Stöchiometrie von 1:8
(Lee et al., 1999).
40

Ergebnisse
Abb.4 Sowohl der V1-Komplex als auch das V1Vo-Holoenzym co-pelletieren mit Aktinfilamenten. 0,2
µM F-Aktin wurde mit verschiedenen Konzentrationen des V1-Komplexes bzw. des V1Vo-Holoenzyms inkubiert
und schließlich bei 200.000 x g 60 min zentrifugiert. A, Pellets der Ansätze mit dem V1-Komplex. B, Pellets der
Ansätze mit dem V1Vo-Holoenzym. C, Abhängigkeit der co-pelletierten V-ATPase von der Konzentration an
Gesamt-ATPase. Der Gehalt an V-ATPase im Pellet wurde mit dem Amidoschwarz-Test bestimmt.
41

Ergebnisse
4.1.3. Sowohl Untereinheit B als auch Untereinheit C vermitteln die Bindung an Aktin
Bei der Rinder-V-ATPase war gezeigt worden, dass die Untereinheit B für die Bin-
dung an Aktinfilamenten verantwortlich ist (Holliday et al., 2000). Diese Aussage wurde auch
für die V-ATPase aus Tabakschwärmerraupen überprüft. Dafür wurde das V1Vo-Holoenzym
bzw. der V1-Komplex nach SDS-PAGE auf eine Nitrocellulose-Membran geblottet und ein
Overlayblot mit F-Aktin (Abb. 5A, Bahn 2 und 3) durchgeführt. Das gebundene Aktin wurde,
wie erwartet, im Bereich der Untereinheit B sowohl beim Holoenzym als auch beim V1-
Komplex detektiert (Abb. 5B, Bahn 2 und 3).
Abb.5 Sowohl Untereinheit B als auch Untereinheit C vermitteln die Interaktion der V-ATPase mit F-
Aktin. 5 µg einer Mischung aus Phosphorylase b (97 kDa), BSA (66 kDa), Ovalbumin (45 kDa), Carboanhydrase
(30 Kda), Trypsin Inhibitor (20 kDa) und α-Laktalbumin (14 kDa) als Molmassen-Standards (St), 1µg Aldolase
als Positiv-Kontrolle für die F-Aktin Bindung (1), 5µg V1Vo-Holoenzym (2), 5 µg V1-Komplex (3) und 0,3
µg rekombinante Untereinheit C (4) wurden nach SDS-PAGE auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Der
folgende Overlayblot mit F-Aktin wurde nach Methode 3.1.14. durchgeführt und das gebundene Aktin mit einem
Antiserum gegen Aktin detektiert (B). A, Färbung mit Ponceau S. C, Kontrolle in Abwesenheit von F-Aktin. Die
Western Blots wurden mir von Dr. Hans Merzendorfer zur Verfügung gestellt.
Überraschenderweise war ein starkes Signal auch im 40 kDa-Bereich des V1Vo-
Holoenzyms zu sehen (Abb. 5B, Bahn 2). Das Holoenzym enthält allerdings zwei Unterein-
heiten, die ca. 40 kDa groß sind, die Untereinheit C des cytosolischen V1-Komplexes und die
Untereinheit d des membrangebundenen Vo-Komplexes. Trotz nahezu gleicher molekularer
Massen laufen diese Untereinheiten in einem 17 % SDS-Gel als getrennte Banden. Die Unter-
einheit C läuft ein wenig schneller und lässt sich mit Ponceau S gut färben; die Untereinheit d
läuft etwa langsamer und ist mit Ponceau S nur schwach detektierbar (Abb. 5A, Bahn 2). Bei
genauerer Analyse der Membranen konnte daher festgestellt werden, dass die Untereinheit C,
nicht jedoch die Untereinhet d mit F-Aktin interagiert. Die weitgehende Abwesenheit des
42

Ergebnisse
Signals beim gereinigten V1-Komplex (Abb. 5B, Bahn 3) ist dabei durch substöchiometrische
Mengen an Untereinheit C zu erklären (Wieczorek et al., 2003).
Die Interaktion der Untereinheit C mit F-Aktin wurde zusätzlich per Overlayblot mit
rekombinanter Untereinheit C überprüft, mit dem Ergebnis, dass auch in diesem Fall eine po-
sitive Reaktion festzustellen war (Abb. 5B, Bahn 4). Damit wird die Interaktion der V-
ATPase von Tabakschwärmerraupen mit Aktinfilamenten nicht nur, wie aufgrund der bisheri-
gen Untersuchungen an der Rinder-V-ATPase anzunehmen war, durch die Untereinheit B,
sondern auch durch die Untereinheit C vermittelt.
4.1.4. Co-Pelletierung der Untereinheit C mit F-Aktin
Die Interaktion der Untereinheit C mit Aktinfilamenten wurde mittels Co-
Pelletierung überprüft. Die rekombinante Untereinheit C wurde in einer Konzentrationsreihe
von 0,2 µM bis 1µM mit 0,2 µM F-Aktin inkubiert und schließlich bei 200.000 x g zentrifu-
giert. Auf einem SDS-Gel der Pellets ist die co-pellettierte Untereinheit C (42 kDa) durch-
wegs zusammen mit Aktin (45 kDa) zu sehen (Abb. 6A).
Abb.6 Die rekombinante Untereinheit C co-pelletiert mit Aktinfilamenten. F-Aktin (0,2 µM) und die rekombinante
Untereinheit C (0,2 µM bis 1 µM) wurden in F-Puffer mit 10 mM DTT 2 Stunden bei Raumtemperatur
inkubiert und danach 60 min bei 200.000 x g sedimentiert. Die resultierenden Pellets wurden mittels SDS-
PAGE und Silber-Färbung analysiert (A). Der Gehalt an Aktin und an Untereinheit C im Pellet wurde mit dem
Amidoschwarz-Proteintest bestimmt (B).
43

Ergebnisse
Die Bindung war abhängig von der Konzentration der Untereinheit C und ging bei
etwa 0,6 µM in Sättigung. Damit konnte die Interaktion der Untereinheit C mit Aktinfilamen-
ten endgültig bestätigt werden. Durch einen Proteintest wurde bestimmt, dass etwa 0,2 µM
Untereinheit C mit 0,2 µM Aktin im Sättigunsbereich co-pelletiert (Abb. 6B), was auf eine
1:1-Stöchiometrie schließen lässt.
4.1.5. Untereinheit C interagiert mit F-Aktin aus Manduca
Wie schon gezeigt wurde, reagierte sowohl die Untereinheit C im V1Vo-Holoenzym
als auch die rekombinante Untereinheit C mit F-Aktin aus Kaninchenmuskel. Trotz der hohen
Ähnlichkeit zum Nicht-Muskel-Aktin aus Tabakschwärmerraupen (EMBL/GenBank) wurde
die Spezifität der Bindung mit Aktin aus Manduca zusätzlich überprüft. Dafür wurde die an
Affi-Gel-Kügelchen kovalent gekoppelte rekombinante Untereinheit C mit zytosolischem Ex-
trakt aus Manduca inkubiert. Als positive Kontrolle wurde die gleiche Menge der gekoppelten
Untereinheit C mit Kaninchenmuskel-Aktin inkubiert. Nach SDS-PAGE und Western Blot
zeigte schon die Anfärbung der Membran mit Ponceau S eine deutliche Bande im Bereich des
Aktins. Die folgende Immunfärbung mit dem polyklonalen Antiserum gegen Aktin bestätigte
diese Vermutung (Abb. 7).
1 2 3 4
Abb.7 Co- Präzipitation des Aktins aus Manduca mit der Untereinheit C. Die an Affi-Gel 10 gekoppelte
rekombinante Untereinheit C wurde mit dem zytosolischen Extrakt aus Manduca bzw. mit F-Aktin aus Kaninchenmuskel
als Positivkontrolle 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen der Kügelchen wurden
die gebundenen Proteine durch Kochen in Laemmli-Puffer mit 9,6 mM ß-Mercaptoethanol eluiert, per SDS-
PAGE getrennt, auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen, zunächst mit Ponceau und dann mit dem Antiserum
gegen Aktin getestet. 1 und 3, Inkubation mit 24 µM F-Aktin; 2 und 4, Inkubation mit Zytosol aus dem Mitteldarm
von Manduca.
44

4.1.6. Untereinheit C erhöht die Affinität des V1-Komplexes zu Aktin
Ergebnisse
Die Affinität des V1Vo-Holoenzyms zu Aktinfilamenten ist, wie in Abbildung 4 be-
schrieben, deutlich höher als die des V1-Komplexes. Ein möglicher Grund hierfür könnte in
der Tatsache liegen, dass zwar sowohl das V1Vo-Holoenzym als auch der V1-Komplex je drei
B-Untereinheiten besitzen, dass aber die Untereinheit C im gereinigten V1-Komplex (Abb.
4A), im Gegensatz zum V1Vo-Holoenzym (Abb. 4B), nur in substöchiometrischen Mengen
vorkommt.
Abb.8 Die Untereinheit C erhöht die Affinität der V-ATPase zu Aktin. Nach Methode 3.1.16. wurden
V1-Komplexe mit (V1C) und ohne (V1) Untereinheit C hergestellt (A). Verschiedene Konzentrationen beider V1-
Komplexe wurden mit 0,2 µM F-Aktin 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und schließlich 60 min bei
200.000 x g zentrifugiert. Resultierende Pellets wurden mittels SDS-PAGE mit anschließender Silber-Färbung
(B) und Amidoschwarz-Proteintest (C) analysiert.
45

Ergebnisse
Demnach könnte die C-Untereinheit als eine zusätzliche Bindungsstelle die Interak-
tion des V1Vo-Holoenzyms mit F-Aktin verstärken. Um diese Hypothese zu prüfen, wurden
V1-Komplexe mit und ohne Untereinheit C hergestellt (Abb. 8A).
Die beiden durch die An- bzw. Abwesenheit von Untereinheit C sich unterscheiden-
den V1-Komplexe wurden mit Aktinfilamenten inkubiert und dann co-pelletiert. Bei jeweils
gleichen Konzentrationen ging immer deutlich mehr vom V1 Komplex, der die Untereinheit C
enthielt, zusammen mit Aktin ins Pellet (Abb. 8B). Die Quantifizierung der V-ATPase in den
Pellets per Amidoschwarz-Proteinbestimmung verdeutlichte diese Aussage und belegt damit,
dass die Affinität der V1-ATPase für F-Aktin durch die Anwesenheit von Untereinheit C deut-
lich verstärkt wird (Abb. 8C).
4.2. Interaktion der Untereinheit C mit F- und G-Aktin
4.2.1. Nachweis der freien Untereinheit C im Zytosol von Tabakschwärmerraupen
Beim Hungern oder während der Häutung der Raupen dissoziiert der V1-Komplex
vom membrangebundenen Vo-Komplex (Sumner et al., 1996; Gräf et al., 1996). Dabei verliert
der V1-Komplex die Untereinheit C (Kane, 2000; Wieczorek et al., 2000), die damit wie der
V1-Komplex frei im Zytosol vorkommt. Da freie zytosolische V1-Komplexe, wenn auch in
geringerer Konzentration, bei fressenden Raupen ebenfalls vorkommen, erhob sich die Frage,
ob dies auch für die Untereinheit C gelten würde. Um in einem zytosolischen Extrakt freie
Untereinheit C von an den V1-Komplex gebundener Untereinheit C zu unterscheiden, wurde
zunächst geprüft, wie sich die rekombinante Untereinheit C in einem Saccharose-Gradienten
verteilt. Nach einer Zentrifugation in einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten war die
rekombinante Untereinheit C hauptsächlich in der 10 %-Fraktion zu finden (Abb. 9).
Abb.9 Verteilung der Untereinheit C im Saccharosedichtegradienten. Etwa 210 µg rekombinante Untereinheit
C in LOM wurde auf einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten (3 ml 40 %, 2 ml 30 %, 2 ml 20 %
und 1,6 ml von 10 % Saccharose in TEM mit 0,2 M NaCl) aufgetragen und 90 min bei 310.000 x g und 4°C
(VTi 65.1, Beckman) zentrifugiert. Dann wurde der Gradient 1 ml-weise aliquotiert und Proben der Fraktionen
mittels SDS-PAGE und Coomassie-Färbung analysiert.
46

Ergebnisse
Im Gegensatz dazu befand sich der V1-Komplex in der 30 %-Fraktion und dem unte-
ren Teil der 20 %-Fraktion (Gräf, 1996). Demnach besteht die Möglichkeit, in einem zytosoli-
schen Extrakt zwischen der an den V1-Komplex gebundenen und der freien Untereinheit C zu
unterscheiden.
Raupendärme wurden unter Aktin-polymerisierenden Bedingungen zuerst homoge-
nisiert, und dann wurden Aktinfilamente und Membranen, die u.a. auch V1Vo-Holoenzym ent-
halten, mittels Zentrifugation aus dem Homogenat entfernt. Die den V1-Komplex enthaltende
Fraktion und die 10 %-Fraktion wurden nach der Zentrifugation in einem diskontinuierlichen
Sachharosedichtegradienten gesammelt und mittels eines monoklonalen Antikörpers gegen
die C-Untereinheit analysiert. Die linke Bande in Abbildung 10 präsentiert zeigt die an den
V1-Komplex gebundene Untereinheit C, die rechte Bande stellt die freie Untereinheit C dar.
Damit zeigte es sich, dass die Untereinheit C auch bei fressenden Raupen frei im Zytosol vor-
kommt.
Abb.10 Nachweis der freien Untereinheit C im Zytosol des Mitteldarms von Manduca (siehe 3.1.17.).
F-Aktin- und membranfreies Homogenat aus dem Mitteldarm wurde auf einen Saccharosegradienten (3 ml 40 %,
2 ml 30 %, 2 ml 20 % und 1,6 ml von 10 % Saccharose in TEM-Puffer mit 0,2 M NaCl) aufgetragen und 90 min
bei 310.000 x g und 4°C zentrifugiert. Die den V1-Komplex enthaltende Fraktion (30 % Saccharose und der unterste
ml von 20 % Saccharose) und die 10 %-Fraktion, die die freie Untereinheit C enthält, wurden gesammelt
und nach SDS-PAGE auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Die Untereinheit C wurde mittels eines monoklonalen
Antikörpers detektiert. Die linke Bande repräsentiert die den V1-Komplex enthaltende Fraktion, die
rechte Bande die Fraktion, die die freie Untereinheit C enthält.
4.2.2. Untereinheit C bindet sowohl F- als auch G-Aktin
Die vorangegangenen Experimente haben gezeigt, dass im Zytosol von Tabak-
schwärmerraupen immer eine gewisse Menge freier Untereinheit C vorkommt, die damit auch
an Aktinfilamente binden könnte. Da das Zytoplasma jeder eukaryotischen Zelle grundsätz-
lich einen sogenannten G-Aktin-Pool enthält, der für die Dynamik des Aktin-Zytoskeletts es-
sentiell ist (Fechheimer and Zigmond, 1993; Weeds, 1982), wurde überprüft, ob dies auch für
den Mitteldarm von Manduca gilt. In der Tat war im Zytosol neben F-Aktin, wie schon ge-
zeigt (Abb. 3), auch G-Aktin nachweisbar (Abb. 11).
47

Ergebnisse
Abb.11 G-Aktin-Pool im Zytosol des Mitteldarms von Tabakschwärmerraupen. Mitteldärme von fressenden
Raupen wurden in F-Puffer mit 5 mM Pefabloc SC mit einem Glashomogenisator (Wheaton) vorsichtig
homogenisiert, um die Aktinfilamente nicht zu zerstören. Nach Entfernung der Aktinfilamente sowie der Membranen
durch eine Zentrifugation von 60 min bei 200.000 x g und 4°C wurde der Überstand auf ein SDS-Gel aufgetragen.
Nach SDS-PAGE eines Aliquots des Überstandes wurden die Proteine auf eine Nitrocellulose-
Membran übertragen und dann eine Immunfärbung mit polyklonalem Antiserum gegen Aktin durchgeführt. 1,
Färbung mit Ponceau S. 2, Immunfärbung.
Das Ergebnis ließ allerdings keinen Rückschluss darauf zu, dass ein G-Aktin-Pool in
allen Zelltypen der Mitteldarm-Präparation, in der sich nicht nur Gobletzellen, sondern v.a.
Columnarzellen und ein wenig quergestreifte Muskulatur befand, vorkommt. Trotzdem pro-
vozierte der Befund die Idee, dass die Untereinheit C i den Gobletzellen möglicherweise auch
mit G-Aktin wechselwirken könnte. Dies wurde mittels eines Overlayblots mit G-Aktin über-
prüft. Die rekombinante Untereinheit C, Aldolase als eine positive Kontrolle für F-Aktin-
Bindung und BSA als eine Kontrolle für unspezifische Protein-Protein-Interaktion wurden
mittels der Slotblot-Technik auf zwei Nitrocellulosemembranen aufgetragen. Mit einer
Membran wurde ein Overlay mit G-Aktin durchgeführt, die andere wurde zur Kontrolle mit
F-Aktin behandelt.
Abb.12 Im Overlayblot reagiert die Untereinheit C sowohl mit F- als auch mit G-Aktin. Rekombinante
Untereinheit C, Aldolase als eine positive Kontrolle für F-Aktin-Bindung und BSA als eine Kontrolle für unspezifische
Interaktion wurden mittels Slotblot-Technik auf eine Nitrocellulose-Membran aufgetragen und damit ein
Overlayblot mit F-Aktin bzw. G-Aktin durchgeführt. Das gebundene Aktin wurde mit einem monoklonalen Antikörper
gegen Aktin (A 4700) nachgewiesen.
48

Ergebnisse
Der monoklonale Antikörper gegen Aktin detektierte, wie erwartet, das an der Untereinheit C
und an der Aldolase gebundene F-Aktin (Abb. 12, oben). Im Falle des G-Aktins war eine Re-
aktion nur mit der Untereinheit C zu sehen (Abb. 12, unten).
Damit war gezeigt, dass die Untereinheit C tatsächlich auch G-Aktin bindet. Die Re-
levanz dieses Befundes wurde durch Fluoreszenz-Experimente mit NBD-G-Aktin, einer Stan-
dard-Methode für den Nachweis einer Wechselwirkung mit G-Aktin, unabhängig überprüft.
Dafür wurde fluoreszierendes 7-Chloro-4-nitrobenzono-2-oxa-1,3-diazol (NBD) an G-Aktin
kovalent gekoppelt und dieses schließlich in seiner Mg-ATP- und Mg-ADP-Form hergestellt
(siehe 3.1.18.). Die ATP-Form des Aktins kommt überwiegend am sogenannten „Plus“-Ende
von Aktinfilamenten und die ADP-Form an ihrem „Minus“-Ende vor. Entsprechend ihrer
Funktion bevorzugen die meisten Aktin-bindenden Proteine entweder ATP-Aktin oder ADP-
Aktin und weisen dabei einen bis zu 100-fachen Unterschied in der Affinität zwischen dem
ATP- und dem ADP-Status des Aktins auf (Sun et al., 1995). Die konzentrationsabhängige
Steigerung der Fluoreszenz des NBD-Aktins in Gegenwart von rekombinanter Untereinheit C
wurde als Beleg für die Interaktion zwischen beiden Proteinen gewertet (Abb. 13).
Abb.13 Interaktion der Untereinheit C mit G-Aktin. Fluoreszenzsteigerung von 0,2 µM NBD-markiertem
Mg-ATP-G-Aktin (gefüllte Dreiecke) oder Mg-ADP-G-Aktin (Kreise) in Abhängigkeit von der Konzentration
rekombinanter Untereinheit C. Die Symbole stellen die Daten von drei unabhängigen Versuchen dar. Die Kd-
Werte wurden für eine angenommene Stöchiometrie von 1:1 berechnet.
Die Dissoziationskonstanten der Untereinheit C für ATP- bzw. ADP-Aktin wurden
berechnet, indem die Fluoreszenzänderungen als Funktion der Konzentration der Untereinheit
C für eine Bindungskurve auf der Basis eines Komplexes mit einer 1:1-Stöchiometrie ange-
passt wurden. Dissoziatioskonstanten von 52 nM für ATP-Aktin und 62 nM für ADP-Aktin
(Abb. 13) bestätigten nicht nur die postulierte Interaktion zwischen der Untereinheit C und G-
49

Ergebnisse
Aktin, sondern bewiesen auch, dass diese Interaktion hoch spezifisch ist. Auf der anderen Sei-
te weist die Untereinheit C nahezu gleiche Dissoziationskonstanten für ATP- und für ADP-
Aktin auf. Auf Aktinfilamente extrapoliert würde dies bedeuten, dass die Untereinheit C
grundsätzlich überall an diesen binden sollte, ohne Präferenz für das „Plus“- oder das „Mi-
nus“-Ende.
4.2.3. Untereinheit C stabilisiert Aktinfilamente und beschleunigt die Polymerisierung
des Aktins
Zu den Aktin-bindenden Proteinen, die sowohl mit F- als auch mit G-Aktin interagie-
ren, gehören u.a. auch die Mitglieder der sogenannten ADF (actin depolymerizing fac-
tors)/Cofilin-Familie (Ayscough, 1998). In vitro binden diese Proteine an Aktinfilamente mit
einer Stöchiometrie von 1:1 (bezogen auf F-Aktin-Monomere), was in einer pH-abhängigen
Weise zur Depolymerisation der Aktinfilamente führt (Hawkins et al., 1993). Wie schon ge-
zeigt, bindet auch die Untereinheit C sowohl G- als auch F-Aktin, wobei die Stöchiometrie
der Bindung ebenfalls 1:1 ist. Ausgehend von dieser Ähnlichkeit zur ADF/Cofilin-Familie
wurde überprüft, ob auch die Untereinheit C Aktinfilamente depolymerisieren kann. Dafür
wurde F-Aktin mit rekombinanter Untereinheit C unter depolymerisierenden Bedingungen 2
Stunden inkubiert. Nach der anschließenden Sedimentation bei 200.000 x g sollten die Über-
stände das dann entstandene G-Aktin enthalten.
Abb.14 Untereinheit C stabilisiert Aktinfilamente in vitro. Aktin wurde zuerst polymerisiert und das entstehende
F-Aktin durch 60-minütige Zentrifugation bei 200.000 x g gesammelt. Es wurde bis zu einer Endkonzentration
von 10 µM resupendiert und mit 2 µM rekombinanter Untereinheit C in 10 mM Tris-MES-Puffer bei
pH 6,0 (Bahn 3), 7,0 (Bahn 4) und 8,5 (Bahn 5) 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der folgenden
Zentrifugation (60 min bei 200.000 x g) wurden die Überstände mittels SDS-PAGE und Coomassie-Färbung
analysiert. Als positive Kontrolle für die Depolymerisierung wurde ein Ansatz bei pH 7,0 ohne Untereinheit C
verwendet (Bahn 1). Der Ansatz mit 2 µM BSA bei pH 7,0 diente als Kontrolle für einen unspezifischen Proteineffekt
auf die Aktindepolymerisierung (Bahn 2). Die Bahnen 6-8 entsprechen Ansätzen mit 2 µM Untereinheit
C bei pH 6,0, 7,0 und 8,5 in Abwesenheit von Aktin.
50

Ergebnisse
Abb.15 Untereinheit C beeinflusst die Aktinpolymerisation in Lichtstreuungsexperimenten. Die rekombinante
Untereinheit C wurde in verschiedenen Konzentrationen mit 5,7 µM G-Aktin gemischt. Durch Zugabe
von 10-fachem F-Puffer wurde dann die Polymerisation gestartet. A, Signalverlauf während der gesamten Zeit
der Experimente. B, Signalverlauf in der linearen Phase der ersten Minuten. C, Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeit
(siehe B) von der Konzentration der Untereinheit C.
In Ansätzen, in denen F-Aktin zusammen mit der Untereinheit C vorinkubiert wurde,
war allerdings, unabhängig vom pH, weder G-Aktin noch die Untereinheit C im Überstand zu
51

Ergebnisse
sehen (Abb. 14, Bahn 3-5), obwohl F-Aktin alleine (Abb. 14, Bahn 1) oder in Gegenwart von
BSA (Abb. 14, Bahn 2) teilweise depolymerisierte und im Überstand detektiert werden konn-
te. Untereinheit C blieb in Ansätzen ohne Aktin unabhängig vom pH vollständig im Über-
stand (Abb. 14, 6-8).
Damit war gezeigt, dass die Untereinheit C unabhängig vom pH-Wert keine Fähig-
keit besitzt, Aktinfilamente zu depolymerisieren. Vielmehr bleiben Aktinfilamente durch die
Bindung der Untereinheit C sogar unter depolymerisierenden Bedingungen eindeutig stabiler.
Wenn Untereinheit C schon Aktinfilamente stabilisiert, wäre es interessant zu prüfen,
ob sie auch einen Einfluss auch auf Polymerisierung des Aktins ausübt. Diese Hypothese
wurde mit Hilfe von Lichtstreuungsexperimenten überprüft. Das Verfahren beruht auf dem
Phänomen, dass die Lichtstreuung von Teilchen direkt proportional zu ihrer Größe ist
(Cooper and Pollard, 1982; Kang et al., 1999). Es zeigte sich, dass die Geschwindigkeit der
Polymerisation eindeutig abhängig war von der Konzentration der Untereinheit C (Abb. 15A).
Während der ersten 3 Minuten nach dem Start der Polymerisation war die Zunahme der
Lichtstreuung exakt linear (Abb. 15B) und nahm dann langsam ab. Die Anfangsgeschwindig-
keit war abhängig von der Konzentration der Untereinheit C mit einem Maximum bei 0,4 µM
(Abb. 15C).
4.2.4. Bündelung der Aktinfilamente durch die Untereinheit C
Der gerade demonstrierte positive Einfluss der Untereinheit C auf die Aktinpolyme-
risation erklärt noch nicht, ob es sich dabei nur um die Verlängerung einzelner Aktinfilamente
handelte oder ob es dabei auch zu einem Crosslinking der Aktinfilamente kam. Diese Frage
wurde durch differentielle Zentrifugation überprüft, da einzelne Aktinfilamente erst nach frü-
hestens 1 Stunde bei 100.000 x g sedimentieren, miteinander vernetzte Aktinfilamente hinge-
gen schon nach 20 Minuten bei 20.000 x g. Um als Ausgangsbedingung gleich große Aktinfi-
lamente zu erhalten, wurde Aktin in Gegenwart von Gelsolin polymerisiert und schließlich
mit Phalloidin stabilisiert. Auf solche Weise vorbereitetes F-Aktin wurde zusammen mit der
Untereinheit C inkubiert und danach 20 Minuten bei 20.000 x g zentrifugiert. Tatsächlich
konnte das durch die Untereinheit C vernetzte Aktin im Pellet detektiert werden, während so-
wohl Aktin als auch Untereinheit C getrennt voneinander im Überstand bleiben (Abb. 16).
52

Ergebnisse
Abb.16 Untereinheit C vernetzt Aktinfilamente in vitro. Das mit Phalloidin stabilisierte F-Aktin (0,4 µM)
wurde mit 0,2 µM rekombinanter Untereinheit C 90 min inkubiert und schließlich 20 min bei 20.000 x g zentrifugiert.
Pellets (P) und Überstände (Ü) wurden per SDS-PAGE und Silber-Färbung analysiert.
Die Ergebnisse belegen damit, dass die Untereinheit C tatsächlich Aktinfilamente
bündelt. In einem unabhängigen Ansatz wurde diese Aussage mit FITC-Phalloidin-markierten
Aktinfilamenten fluoreszenzmikroskopisch überprüft. Ohne Untereinheit C war F-Aktin als
einzelne Filamente zu erkennen (Abb. 17A).
Abb.17 Untereinheit C bündelt Aktinfilamente. 0,2 µM F-Aktin wurde mit FITC-Phalloidin stabilisiert und
in Abwesenheit (A) oder in Gegenwart von 14 µM Untereinheit C (B) 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die
Verdünnung der Untereinheit C bis zu einer Konzentration von 7 µM und sowie die Verdoppelung der Aktin-
Konzentration führten zu keiner Änderung der Ergebnisse.
53

Ergebnisse
In Gegenwart von Untereinheit C änderte sich das Bild drastisch: Aktinfilamente bil-
deten jetzt dicke Bündel, die nicht nur parallel liefen, sondern auch maschenartige Strukturen
bildeten, die als Quervernetzung zu interpretieren waren (Abb. 17B).
4.2.5. Aktin-Bindungsstellen der Untereinheit C
Um die Aktin-Bindungsstellen der Untereinheit C einzugrenzen, wurden zwei re-
kombinante Proteine hergestellt. Eines der beiden bestand aus den Aminnosäuren 1 bis 191
und repräsentierte damit die aminoterminale Hälfte der Untereinheit C, das andere entsprach
mit den Aminosäuren 190 bis 385 deren carboxyterminaler Hälfte. Mit den beiden „Hälften“
wurden Overlayblots mit F- und G-Aktin durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl
die aminoterminale als auch die carboxyterminale Hälfte der Untereinheit C mit G-Aktin und
mit F-Aktin interagieren (Abb. 18).
Abb.18 Beide Hälften der Untereinheit C reagieren sowohl mit F- als auch mit G-Aktin. Nach SDS-
PAGE wurde die rekombinante aminoterminale (N, Aminosäurereste 1 bis 191) oder die carboxyterminale (C,
Aminosäurereste 190 bis 385) Hälfte der Untereinheit C auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen und damit
ein Overlayblot mit F- bzw. G-Aktin durchgeführt. Gebundenes Aktin wurde mit dem monoklonalen Antikörper
A-2172 detektiert.
Damit scheint die Untereinheit C zwei offensichtlich gleichwertige Aktin-
Bindungsstellen zu besitzen. Dies könnte ihre Eigenschaft, Aktinfilamente in dicke parallele
Bündel zu packen, erklären (Abb. 19).
Abb.19 Schematische Darstellung der Bündelung von Aktinfilamenten durch zwei Bindungsstellen der
Untereinheit C.
54

4.2.6. Dimerisierung und Oligomerisierung der Untereinheit C
Ergebnisse
Zwei Aktin-Bindungsstellen ermöglichen der Untereinheit C, Aktinfilamente zu ver-
netzen. Eine andere Möglichkeit der Vernetzung von Aktinfilamenten besteht grundsätzlich
darin, dass die Aktin-bindenden Proteine Dimere oder Oligomere bilden (Pfannstiel et al.,
2001). Die Zugabe von DTT führt zur Spaltung von Disulfidbrücken, weswegen die Unter-
einheit C in der SDS-PAGE als eine einzige 42 kDa-Bande zu erkennen war. In Abwesenheit
von Reduktionsmitteln waren tatsächlich hier auch Dimere und Oligomere der Untereinheit C
zu sehen (Abb. 20A). Unter oxidierenden Bedingungen bildeten die beiden Hälften der Unter-
einheit C ebenfalls Dimere, allerdings keine Oligomere (Abb. 20, B). Dies lässt sich leicht er-
klären, da die aminoterminale Hälfte nur ein Cystein besitzt, und die carboxyterminale Hälfte
zwar über zwei Cysteine verfügt, die allerdings, durch nur eine Aminosäure getrennt, nahe
beieinander liegen.
Abb.20 Die Untereinheit C und ihre beide Hälften bilden Dimere/Oligomere unter oxidierenden Bedingungen.
A, Untereinheit C in Gegenwart oder in Abwesenheit von Reduktionsmittel (DTT). B, die aminoterminale
(N) und die carboxyterminale ( C) Hälfte der Untereinheit C in Gegenwart oder in Abwesenheit von DTT.
Coomassie-Färbung nach SDS-PAGE.
Die Zentrifugation der nativen Untereinheit C unter oxidierenden Bedingungen in ei-
nem Saccharosedichtegradienten bestätigte, dass sie nicht nur als Monomer vorliegen kann,
sondern dass sie auch Di- und Oligomere zu bilden in der Lage ist. So befinden sich, entspre-
chend zur Verteilung der Standard-Proteine im Saccharosedichtegradienten (Abb. 21A) in den
55

Ergebnisse
Fraktionen 1-5 die Oligomere der Untereinheit C, die Fraktionen 6-9 enthalten die Dimere
und die Monomere liegen in den Fraktionen 11-15 vor (Abb. 21B).
Die Stabilität der Polymere der Untereinheit C wurde am Beispiel der Dimere getes-
tet. Dafür wurden die Dimere enthaltenden Fraktionen 7 und 8 zusammengemischt und wie-
der auf den gleichen Saccharosedichtegradienten aufgetragen. Nach der Zentrifugation war
die Untereinheit C nicht nur in den Fraktionen 7 und 8 zusehen, sondern verteilte sich über die
Fraktionen 1 bis 13 (Abb. 21C). Damit sind die Dimere der Untereinheit C eine zwar relativ
stabile, aber auch eine dynamische Struktur. Ein großer Teil des Proteins lag als Dimere vor,
ein Teil davon zerfiel zu Monomeren, ein anderer Teil bildete Oligomere.
Abb.21 Nachweis der Oligomerisierung der rekombinanten Untereinheit C im Saccharosedichtegradienten
(siehe 3.1.23.). A, Fraktionen, welche Kaninchenmuskel-Phosphorylase b (97 kDa), Rinderserumalbumin
(66 kDa) and Ovalbumin aus Hühner-Eiweiß (45 kDa) enthalten. B, Verteilung der Untereinheit C. C, Verteilung
der Dimere-enthaltenden Fraktionen nach der nächsten Zentrifugation. Silberfärbung nach SDS-PAGE.
Es könnte natürlich sein, dass die Oligomerisierung der Untereinheit C unter oxidie-
renden Bedingungen ein konzentrationsabhängiger Prozess ist, und dass die Zahl der Mono-
mere mit der Verdünnung der Untereinheit C steigt. Eine Konzentrationsreihe der Unterein-
heit C von 10 µM bis 1 µM zeigte, dass die Verdünnung den Anteil der Monomere nicht än-
derte (Abb. 22). Mit anderen Worten: die Untereinheit C existiert unter oxidierenden Bedin-
gungen und bei Konzentrationen, die auch in der Zelle vorkommen (siehe Diskussion S. 65),
immer als eine heterogene Population, die aus Monomeren, Dimeren und Oligomeren besteht.
56

Ergebnisse
Abb.22 Gleichgewicht zwischen Monomeren, Dimeren und Oligomeren der Untereinheit C unter oxidierenden
Bedingungen. 10 µM (Spur 1), 5 µM (Spur 2), 2 µM (Spur 3) und 1 µM (Spur 4) Untereinheit C
wurde 1 Stunde auf Eis in 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, und 50 mM NaCl inkubiert. Gleiche Aliquots wurden auf
ein SDS-Gel aufgetragen und mit Hilfe einer Coomassie-Färbung visualisiert.
Die Fähigkeit der Untereinheit C, Dimere und Oligomere zu bilden, erweitert we-
sentlich ihre Möglichkeiten, Aktinfilamente zu vernetzen. So könnten Aktinfilamente nicht
nur parallel gebündelt (siehe Abb. 19), sondern auch unter unterschiedlichem Winkel zuein-
ander gebunden werden ( Abb. 23).
Abb.23 Der Winkel der Vernetzung hängt vom Oligomerisierungsgrad der Untereinheit C ab.
4.3. Weitere Eigenschaften der Untereinheit C: Vorversuche
Um die Rolle der Untereinheit C bei der Wechselwirkung mit dem Aktin-Zytoskelett
besser zu verstehen, wurden Vorversuche in zweierlei Hinsicht begonnen, aber im Rahmen
dieser Doktorarbeit nicht zu Ende geführt. Zum Einen sollte versucht werden, ihre Biosynthe-
se zu beeinflussen, und zum Zweiten wurde getestet, ob die Untereinheit C phosphorylierbar
ist.
57

Ergebnisse
4.3.1. RNA-Interferenz
4.3.1.1. Phänotypische Änderungen bei der Entwicklung der Raupen
Einsichten über die Rolle der Untereinheit C bei der Wechselwirkung mit dem Ak-
tin-Zytoskelett kann man grundsätzlich auch dann erhalten, wenn ihre Expression herunterre-
guliert wird. Zur Erniedrigung der Expression wurde ein short interfering RNA-Assay (siR-
NA-Assay) durchgeführt, der schon für viele Zelltypen und bei einer Vielzahl von Organis-
men inkl. Insekten mit Erfolg Anwendung fand. 170 pmol bzw. 850 pmol Untereinheit C
siRNA wurden in die Raupen im 1. Larvalstadium injiziert. Dabei hatten 850 pmol injizierter
siRNA den gleichen Effekt wie 170 pmol, was dafür spricht, dass die Injektion von 170 pmol
schon den Sättigungsbereich erreichte. Aus diesem Grund wird hier nur die Wirkung der Ver-
suche mit 170 pmol vorgestellt. Schon am zweiten Tag nach der Injektion und während der
ganzen Zeit der larvalen Entwicklung zeigten die behandelten Raupen einen deutlichen Unter-
schied im Körpergewicht gegenüber den unbehandelten Raupen (Abb. 24).
Abb.24 Einfluss der Untereinheit C-antisense siRNA auf die Entwicklung von Tabakschwärmerraupen.
170 pmol siRNA wurden in Raupen des 1. Larvalstadiums injiziert (siehe 3.2.6.). Als Kontrolle wurde ein entsprechendes
Volumen des Puffers verwendet. Rechts – behandelte Tiere; links – Kontrolle.
Die behandelten Raupen wuchsen eindeutig langsamer als die Kontrollgruppe, wobei
die Körpermassen an bestimmten Tagen nur 20-30 % im Vergleich zu den unbehandelten
58

Ergebnisse
Raupen betrug (Abb. 25A). Das verlangsamte Wachstum im ersten Larvalstadium führte zur
Verzögerung der Häutung der behandelten Raupen. So befanden sich am zweitem Tag alle
Tiere der Kontrollgruppe schon im zweiten Larvalstadium, während dies nur etwa 60 % der
behandelten Raupen erreichten (Abb. 25 B).
Abb.25 Entwicklung von Tabakschwärmerraupen nach siRNA-Injektion. A – Änderungen des Körpergewichtes
von Raupen während der Entwicklung. Als 100 % wurde das durchschnittliche Körpergewicht von
Raupen aus der Kontrollgruppe bezeichnet. B – Dynamik der Häutung: Lv – Larvalstadium. Die Daten sind auf
zwei unabhängige Experimente mit je 15 Tieren in jeder Gruppe bezogen. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichungen
an.
Die verspätete Häutung führte deshalb zu noch größeren Unterschieden in den Kör-
permassen. Dies führte wiederum zu einer noch stärkeren Verzögerung der Häutung. So gin-
gen nur ca. 40 %, 15 % bzw. 20 % der behandelten Raupen rechtzeitig ins 3., 4. bzw. 5. Lar-
valstadium. Am 12. Tag nach der Injektion waren alle Raupen der Kontrollgruppe zum Ver-
puppen bereit, während nur etwa 20 % der behandelten Tiere diesen Zustand erreicht hatten.
59

Ergebnisse
Es dauerte noch zwei Tage, bis alle behandelten Raupen in den entsprechenden Zustand ka-
men.
Diese Ergebnisse sprechen eindeutig dafür, dass die V-ATPase Untereinheit C eine
essentielle Rolle bei der Entwicklung von Manduca spielt.
4.3.1.2. Änderungen in der Struktur des Mitteldarms
Um die Wirkung der siRNA genauer zu verstehen, wurden die Mitteldärme am 3.
Tag nach der siRNA-Injektion präpariert, Gefrierschnitte angefertigt und diese mit Antikör-
pern gegen die Untereinheiten C, A und d immuncytochemisch untersucht.
Der Mitteldarm der unbehandelten Raupen sah wie erwartet aus: sowohl der Vo-
Komplex (markiert durch die Antikörper gegen die Untereinheit d) als auch V1-Komplex
(markiert durch die Antikörper gegen die Untereinheiten A und C) befanden sich v.a. an der
Gobletzell-Apikalmembran (Abb. 26, rechts). Die gut entwickelten Goblets waren dicht ne-
beneinander lokalisiert.
Im Mitteldarm der behandelten Raupen konnten die fluoreszenzmarkierten Unterein-
heiten und damit die Vo- und V1-Komplexe auch v.a. an der Apikalmembran der Gobletzellen
detektiert werden, was für funktionelles V1Vo-Holoenzym sprach. Trotzdem waren deutliche
Änderungen in der Struktur des Mitteldarmes bei den behandelten Raupen zu sehen (Abb. 26,
links). So enthielt der Mitteldarm vor allem deutlich weniger Gobletzellen, dabei schienen nur
einzelne entsprechend gut entwickelt zu sein, die meisten sahen klein und nicht gewachsen
aus. Mit Hilfe der Durchlichtmikroskopie wurde überprüft, ob es wirklich um die Zahl und
Form der Gobletzellen ging, oder ob die Apikalmembran der meisten Gobletzellen keine V-
ATPase enthielt. In der Tat stimmte das Bild der Goblets im Durchlicht mit der Fluoreszenz-
markierung überein (nicht gezeigt), d.h. jeder Goblet enthielt das V1Vo-Holoenzym. Offen-
sichtlich hatten sich einzelne gut entwickelte Gobletzellen noch vor der siRNA-Injektion ge-
bildet. Der Mangel an Untereinheit C nach der siRNA-Injektion behinderte damit die Ent-
wicklung der Gobletzellen bzw. der Gobletzell-Apikalmembran. Die gesamte Oberfläche der
Gobletzell-Apikalmembran bei den behandelten Tieren erschien viel kleiner im Vergleich zur
Kontrollgruppe. Möglicherweise spielt die V-ATPase Untereinheit C beim Entstehen der
Gobletzell-Apikalmembran und damit bei der Entwicklung des funktionellen Mitteldarmes in
Manduca eine essenzielle Rolle.
60

Ergebnisse
Abb.26 Injektion von siRNA führt zur Verzögerung der Entwicklung des Mitteldarms. Am 3. Tag nach
der siRNA-Injektion wurden die Mitteldärme präpariert und als einzelne Stücke in Lawdowsky-Lösung fixiert.
10 µm dicke Gefrierschnitte wurden mit polyklonalen Antiseren gegen die Untereinheit C (488-1) (A) bzw. d
(813-3) (C) oder mit einem monoklonalen Antikörper gegen die Untereinheit A (Klon 221-9) (B) behandelt
(siehe 3.1.1.).
4.3.2. Phosphorylierung der Untereinheit C
4.3.2.1. Autophosphorylierung
Viele Aktin-bindende Proteine werden in ihrer Aktivität durch Phosphorylierung re-
guliert. Da aus der Literatur bekannt war, dass die Untereinheit B der Rinder-V-ATPase in
Abwesenheit einer Proteinkinase phosphoryliert werden kann (Myers and Forgac, 1993), soll-
te zunächst Entsprechendes auch für die Untereinheit C aus Manduca überprüft werden. Dafür
wurde rekombinante Untereinheit C mit ATP unterschiedlich lang bei Raumtemperatur inku-
61

Ergebnisse
biert. Nach SDS-PAGE sollte das an Protein gebundene Phosphat im Gel über Farbentwick-
lung nachzuweisen sein. Die Untereinheit C zeigte allerdings, wie Abbildung 27 belegt, im
Gegensatz zu Phosvitin als Positivkontrolle, eindeutig kein Signal.
Abb.27 Untereinheit C besitzt keine Autophosphorylierungs-Aktivität. Rekombinante Untereinheit C (10
µM) wurde mit 2 mM ATP (3) oder ohne ATP (4) 12 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach SDS-PAGE
wurde gebundenes Phosphat mit Hilfe einer Phosphoprotein-Färbung (siehe 3.1.24.) im Gel detektiert. 1- Soybean
Trypsin Inhibitor als Negativ-Kontolle und 2 –Phosvitin als Positiv-Kontrolle für Phosphoprotein-Färbung.
4.3.2.2. Phosphorylierung durch Proteinkinase A
Für die Katalyse der Phosphorylierung von Proteinen bei Eukaryoten ist die cAMP-
abhängige Proteinkinase A (PKA) von größter Bedeutung (Taylor et al., 1990). Das zytosoli-
sche Vorkommen von freier Untereinheit C bei Manduca führte zu der Idee, dass ihre
Phosphorylierung möglicherweise durch die PKA kontrollieren werden könnte. In der Tat
konnte mit der Phosphoprotein-Färbung ein, allerdings äußerst schwaches, Signal bei der Un-
tereinheit C, die mit PKA inkubiert worden war, detektiert werden (Abb. 28).
Abb.28 Proteinkinase A scheint die Untereinheit C zu phosphorylieren. 10 µg Untereinheit C wurde mit
50 U katalytischer Untereinheit der PKA in 20 mM Hepes (pH 7,5), 0,1 M NaCl, 4 mM MgCl2, 10 mM DTT,
0,1 % NLS und 2 mM ATP 1 Stunde bei 30°C inkubiert. Nach SDS-PAGE wurde die Phosphoprotein-Färbung
(siehe 3.1.24.) und anschließend die Coomassie-Färbung durchgeführt. Histone dienten als Positv-Kontrolle für
die Aktivität der PKA.
62

Ergebnisse
Die Wechselwirkung der Untereinheit C mit der katalytischen Untereinheit der PKA
wurde mittels Overlayblot überprüft. Ein konzentrationsabhängiges Immunsignal bestätigte
die Interaktion der katalytischen PKA-Untereinheit mit der V-ATPase Untereinheit C aus
Manduca (Abb. 29).
Abb.29 Untereinheit C bindet an Proteinkinase A. 1,5 µg bzw. 6 µg katalytische Untereinheit der PKA aus
Rind wurden per Slotblot-Technik auf eine Nitrocellulosemembran aufgetragen. Nach einstündigem Blocken in
3 % Gelatine wurde die Blotmembran mit 0,35 µM Untereinheit C in Verdünnungspuffer 60 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Gebundene Untereinheit C wurde mit polyklonalem Antiserum gegen die Untereinheit C (siehe
3.1.13.) detektiert.
Der Ansatz mit radioaktivem ATP diente als endgültiger Beweis dafür, dass die Un-
tereinheit C durch PKA phosphoryliert werden kann (Abb. 30). Während ohne PKA keinerlei
Signal zu detektieren war, fand sich in deren Gegenwart eine stark markierte Bande phospho-
rylierter Untereinheit C. Auch die PKA war, entsprechend ihrer niedrigeren Konzentration al-
lerdings schwächer, phosphoryliert.
Abb.30 Proteinkinase A phosphoryliert die Untereinheit C. Rekombinante Untereinheit C (6 µM) wurde
mit der katalytischen Untereinheit der Rinder-PKA (0,4 µM) in Gegenwart von radioaktivem ATP inkubiert
(siehe 3.1.26.). Nach SDS-PAGE wurde das Gel mit Coomassie gefärbt, auf Whatmanpapier getrocknet, über 2
Tage auf einem Phosphoscreen exponiert und schließlich mit einem Phosphoimager ausgewertet. 1- 1,16 µg, 2 -
2,32 µg und 3- 3,48 µg Untereinheit C wurden pro Geltasche aufgetragen.
63

5. Diskussion
Diskussion
In Mitteldarm von Manduca ist die Plasmamembran-V-ATPase mit dem Aktin-
Zytoskelett co-lokalisiert. Die Wechselwirkung der V-ATPase mit Aktinfilamenten wurde
nicht nur für ihre Untereinheit B nachgewiesen, wie dies bei Osteoklasten gezeigt worden war
(Holliday et al., 2000), sondern auch für die Untereinheit C. Bei der reversiblen Dissoziation
des V1-Komplexes vom membrangebundenen Vo-Komplex trennen sich Untereinheit C und
V1-Komplex größtenteils voneinander und kommen damit beide frei im Zytosol vor
(Wieczorek et al., 2000). Die Reassoziation der V-ATPase findet ohne de novo-Synthese der
Untereinheiten statt, was bedeutet, dass hierfür freie zytosolische Untereinheit C sowie zyto-
solischer V1-Komplex zur Verfügung gestellt werden (Wieczorek et al., 1999).
In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass eine gewisse Menge freier Unterein-
heit C im Zytosol durchwegs vorkommt. Nach Gräf et al. (1996) enthält 1 g Mitteldarm
(Frischgewicht) etwa 0,27 mg V1-Komplex. Der Mitteldarm besteht zu 50 % aus Wasser, von
dem die Hälfte im extrazellulären Bereich liegt (Koch and Moffett, 1987). Damit befinden
sich 0,27 mg V1-Komplex in 0,25 g bzw. ca. 0,25 ml Zytosol. Das entspricht einer Konzentra-
tion von etwa 2 µM, wenn man von einer molekularen Masse des V1-Komplexes ohne Unter-
einheit C von ca. 530 kDa ausgeht. Dies bedeutet, dass auch mindestens ca. 2 µM freier Un-
tereinheit C im Zytosol vorkommen sollten.
Zu einem ähnlichen Wert führten Berechnungen, die auf 100 mg als einem durch-
schnittlichen Protein-Gehalt in 1ml Zytosol lebender Zellen basierten (Burg, 2000; Stephens
et al., 1991). Der V1-Komplex macht ca. 1 % vom gesamten Protein-Gehalt des Mitteldarms
aus (Gräf et al., 1996). Dies entspricht einer Konzentration von etwa 1,9 µM.
Die berechnete Konzentration von 2 µM dürfte ein unterer Schätzwert sein, da
Goblet-Zellen höchstens 20 % des Zellvolumens im Mitteldarm ausmachen. Daher erscheint
es möglich, dass der freie V1-Komplex bzw. die freie Untereinheit C im Zytosol der Goblet-
Zellen eine Konzentration von etwa 10 µM aufweisen. Damit liegen die in meinen Versuchen
verwendeten in vitro-Konzentrationen der Untereinheit C unter bzw. im Bereich der zytosoli-
schen Konzentrationen. Dies macht es wahrscheinlich, dass die freie Untereinheit C tatsäch-
lich ein physiologisch relevanter Interaktionspartner für Aktin sein dürfte.
Die freie Untereinheit C kann, wie in dieser Arbeit gezeigt, sowohl an Aktinfilamen-
te als auch an G-Aktin binden. Die Interaktion mit G-Aktin ist hoch spezifisch und unabhän-
gig vom Aktin-Nukleotid-Zustand. Dies unterscheidet die Untereinheit C von den meisten G-
65

Diskussion
Aktin-bindenden Proteinen, die entweder ATP-Aktin oder ADP-Aktin vorziehen. So haben
Profilin und ß-Thymosin etwa 10-fach bzw. 100-fach höhere Affinität zum ATP-Aktin als
zum ADP-Aktin (Sun et al., 1995), während die Proteine der ADF/Cofilin Familie oder Twin-
filin lieber mit ADP-Aktin interagieren (Palmgren et al., 2002). Damit könnte die Untereinheit
C ein universales und hochspezifisches G-Aktin-bindendes Protein darstellen und eine wich-
tige Rolle für die Dynamik des zytosolischen G-Aktin-Pools und damit auch des gesamtes
Aktin-Zytoskeletts spielen. Die Interaktion mit F-Aktin und vor allem die Fähigkeit, Aktinfi-
lamente zu vernetzen, weisen auf vielseitige Wechselwirkungen der Untereinheit C mit dem
Aktin-Zytoskelett hin.
Die Phosphorylierung der Untereinheit C, katalysiert durch die cAMP-abhängige
Proteinkinase A, lässt eine mögliche Schlüssel-Rolle nicht nur bei der Regulation der rever-
siblen Dissoziation der V-ATPase und damit bei der Regulation der enzymatischen Aktivität
der V-ATPase, sondern auch bei der Regulation der Interaktion der V-ATPase bzw. der freien
Untereinheit C mit dem Aktin-Zytoskelett vermuten.
5.1. Interaktion mit Aktinfilamenten als generelle Eigenschaft von
V-ATPasen
Bei Tabakschwärmerraupen ist die Plasmamembran-V-ATPase mit Nicht-Muskel-
Aktinfilamenten in den apikalen Membranen der Malpighi-Gefäße, der Speicheldrüsen und
der Gobletzellen co-lokalisiert. Die Co-Lokalisation einer V-ATPase mit Aktinfilamenten
wurde auch bei den Säuger-Osteoklasten während ihrer Aktivierung betrachtet (Lee et al.,
1999). Da sowohl die V-ATPase aus Manduca als auch die V-ATPase von Osteoklasten mit
Aktinfilamenten interagieren, könnte dies eine generelle Eigenschaft zumindest von Plasma-
membran-V-ATPasen darstellen. Untypisch für ein membrangebundenes Protein ist dabei die
direkte Bindung der V-ATPase an Aktinfilamente, ohne dass Linker-Proteine dazwischenge-
schaltet sind.
Wie im Overlayblot gezeigt worden war, wurde die Wechselwirkung der V-ATPase
aus Manduca mit Aktinfilamenten durch die beiden Untereinheiten B und C vermittelt. Dies
widerspricht partiell den Ergebnissen der Untersuchungen mit der V-ATPase aus Oste-
oklasten und Rindernieren, wo nur die Untereinheit B als Aktinbindungsstelle detektiert wor-
den war (Holliday et al., 2000). Dieser Unterschied könnte durch die Art der Isolierung der V-
ATPase, nämlich durch Immunpräzipitation mit einem Antikörper gegen Untereinheit E, er-
66

Diskussion
klärt werden. Die dort publizierte Abbildung lässt es als sehr wahrscheinlich erscheinen, dass
nicht, wie angegeben, das VoV1-Holoenzym isoliert wurde, sondern vorwiegend der zytosoli-
sche V1-Komplex, der nur substöchiometrische Menge der Untereinheit C enthält (Holliday et
al., 2000). Obwohl die Untereinheit C alleine nur eine relativ niedrige Affinität zu Aktinfila-
menten aufweist (Abb. 31), erhöht ihre Anwesenheit im V1-Komplex deutlich die Affinität
des V1Vo-Holoenzyms zu Aktin (siehe Abb. 8).
Bindung zum Aktin [%]
100
80
60
40
20
0
0 200 400 600 800 1000 1200
Abb.31 Relative Affinität zu Aktinfilamenten.
Untereinheit C
V1-Komplex
Holoenzym
Konzentration [nM]
Dieser Befund provoziert die folgende Idee über die möglicherweise essenzielle Rol-
le der Untereinheit C bei der reversiblen Dissoziation der V-ATPase. An der Gobletzell-
Apikalmembran könnte das V1Vo-Holoenzym von Aktinfilamenten stabilisiert und befestigt
werden. Die Interaktion findet durch die Untereinheiten B und C statt und ist damit relativ sta-
bil. Wenn die Untereinheit C die V-ATPase bei der Dissozation des V1-Komplexes vom
membrangebundenen Vo-Komplex verlässt, sinkt die Affinität des V1-Komplexes zu den Ak-
tinfilamenten deutlich und genügt nicht mehr, um den V1-Komplex zu binden. Die V1-
Köpfchen fallen ab und dissoziieren ins Zytosol. Während das V1Vo-Holoenzym normaler-
weise mit Aktinfilamenten am Rand der Gobletzell-Apikalmembran co-lokalisiert ist (siehe
Abb. 3), sind nach der Dissoziation des V1-Komplexes vom Vo-Komplex keine Aktinfilamen-
te zusammen mit dem V1-Komplex im Zytosol zu sehen (Abb. 32).
67

Diskussion
Abb.32 Immunlokalisierung des V1-Komplexes, der Untereinheit C und des F-Aktins. 10 µm dicke Gefrierschnitte
des Mitteldarmes von hungernden Tabakschwärmerraupen wurden mit dem monoklonalem Antikörper
221-9 gegen die Untereinheit A (A) bzw. polyklonalem Antiserum 488-1 gegen die Untereinheit C (B)
gefärbt. Aktinfilamente wurden mit FITC-Phalloidin visualisiert (C). a, apikal; b, basal. Mit den Pfeilen ist der
zytosolische Bereich der Gobletzellen bezeichnet. Das Bild wurde mir von Dr. Hans Merzendorfer zur Verfügung
gestellt.
5.2. Die V-ATPase als Anker des Aktin-Zytoskeletts zur Plasmamembran
Viele lebensnotwendige Eigenschaften von Zellen werden durch die Assoziation des
Aktin-Zytoskeletts mit der Plasmamembran bestimmt und reguliert. Dazu gehören nicht nur
die mechanische Stabilität, die Form und Regulation des Volumens, sondern auch die Wech-
selwirkung zwischen Zellen durch die Adhäsion und die Bildung von Lamellipodien und Fi-
lopodien, die die Beweglichkeit und Migration bestimmter Zelltypen ermöglichen.
Als Transmembrankomponenten nehmen bei der Kopplung der Aktinfilamente mit
der Plasmamembran sowohl die Adhäsions-Transmembranproteine (Sastry and Burridge,
2000) als auch verschiedene Ionen-Transporter teil (Denker and Barber, 2002). Vertreter bei-
der Gruppen binden am Aktin-Zytoskelett mit Hilfe von sogenannten Linker-Proteinen, die
als Adaptoren dienen.
Eines dieser Adaptor-Systeme besteht aus Ankyrin und Spectrin (Bennett and
Baines, 2001). Das an ein Transmembranprotein gebundene Ankyrin interagiert mit dem
Spectrin, einem Protein, das mit Aktinfilamenten fest assoziiert ist (Abb. 33A). Ein anderes
System bilden die ERM-Proteine (Ezrin, Radixin und Moesin) und die Mitglieder der für die
Stabilität der Blutkörperchen verantwortlichen 4.1-Familie (Bretscher et al., 2000; Chishti et
al., 1998). Diese Proteine haben an ihrem aminoterminalen Ende eine Domäne, die an Trans-
membranproteine bindet, ihr carboxyterminales Ende interagiert aber direkt oder über weitere
Adaptoren mit Aktinfilamenten (Abb. 33, B).
68

Diskussion
Abb.33 Assoziation des Aktin-Zytoskeletts mit der Plasmamembran. AP (Adaptor-Protein) stellt die
REM-Proteine und Mitglieder der 4.1.-Familie dar.
An der Assoziation des Aktin-Zytoskeletts mit der Plasmamembran sind verschiede-
ne Arten von Ionen-Transportern wie Antiporter, Ionenkanäle und P-ATPasen beteiligt. So
verankern die spannungsabhängigen Na + -Kanäle die Aktinfilamente mit Hilfe von Ankyrin an
der Plasmamembran von Gehirn-Neuronen (Srinivasan et al., 1988), und die Amilorid-
sensitiven Na + -Kanäle tun dasselbe in den Mikrovilli von Epithelzellen (Smith et al., 1995).
Beispiele für Ionen-Transporter sind Na + /H + -Antiporter (Denker et al., 2000), Na + /Ca 2+ -
Antiporter (Reeves et al., 1996) und AE1-, AE2- und AE3- Isoformen der Anionen-
Austauscher in Erythrozyten (Jons and Drenckhahn, 1992; Denker and Barber, 2002; Jons and
Drenckhahn, 1998). Wie schon erwähnt, können auch P-ATPasen das Aktin-Zytoskelett an
der Plasmamembran festhalten. Am besten sind dabei die Na + /K + - und die H + /K + -ATPasen
untersucht (Kraemer et al., 2003; Agnew et al., 1999; Alper et al., 1994; Festy et al., 2001).
Die Na + /K + -ATPase interagiert über Ankyrin mit dem Spectrin-Aktin-Zytoskelett, die H + /K + -
ATPase dagegen benötigt dafür Ezrin als Linker.
In der Literatur gibt es eine einzige Publikation über eine direkte Interaktion zwi-
schen Aktinfilamenten und einem Ionen-Transporter. Dabei handelt sich um die Na + /K + -
ATPase aus dem Cortex der Ratten-Niere (Cantiello, 1995). Die Interaktion mit Aktin wurde
per Overlayblot detektiert. Dabei wurde die Membran mit 24 µM Aktin in einem Puffer ohne
Block-Protein über Nacht inkubiert. Die viel zu hoch eingesetzte Konzentration des Aktins,
die Abwesenheit eines Blockproteins und die lange Zeit der Inkubation sprechen eindeutig für
69

Diskussion
eine unspezifische Interaktion der Na + /K + -ATPase mit Aktin. Die postulierte Bindung wurde
darüber hinaus mit keiner anderen Methode überprüft.
Damit bleiben die V-ATPasen die einzige Klasse von Transmembranproteinen, die
mit Aktin direkt interagieren. Diese Eigenschaft stellt sie als einen attraktiven Anker des Ak-
tin-Zytoskeletts zur Plasmamembran dar. So kommt die V-ATPase in der Gobletzell-
Apikalmembran mit 5.000 Kopien/µm 2 vor (Wieczorek et al., 2003). Eine so hohe Dichte lässt
wenig Platz für andere Transmembranproteine, die über Linker-Proteine an das Aktin-
Zytoskelett binden könnten. Tatsächlich konnten nach SDS-PAGE gereinigter Gobletzell-
Apikalmembranen außer den Untereinheiten der V-ATPase keine deutlichen Mengen von zu-
sätzlichen Proteinen detektiert werden (Wieczorek et al., 1991). Die Na + /K + -ATPase, die im
Mitteldarm von Drosophila an Ankyrin bindet und dadurch das Aktin-Zytoskelett an die
Plasmamembram koppelt (Baumann, 2001), ist im Mitteldarm von Manduca vollständig ab-
wesend (Jungreis and Vaughan, 1977). Aufgrund dieser Fakten erscheint eine Anker-Funktion
der V-ATPase für das Aktin-Zytoskelett als gut mögliche und plausible Alternative.
5.3. Vergleich der Untereinheit C mit regulatorischen Aktin-bindenden
Proteinen
Die übersichtlichste Einteilung regulatorischer Aktin-bindender Proteine dürfte die
Klassifizierung nach deren Funktionen sein. So kennt man Capping-Proteine, Aktinfilament-
stabilisierende Proteine wie Tropomyosin, G-Aktin-bindende Proteine, Proteine der
ADF/Cofilin Familie und Crosslinking-Proteine. Mit manchen dieser Proteine teilt die V-
ATPase Untereinheit C aus Manduca einige Eigenschaften.
Typische Vertreter der Monomer (G-Aktin)-bindenden Proteine sind Profilin und bei
Vertebraten auch ß-Thymosin. Sie sind etwa 15 kDa bzw. 5 kDa große Proteine, die eine hohe
Affinität (Kd von 0,3 - 0,6 µM) zum ATP-G-Aktin haben (Carlier et al., 1993; Pantaloni and
Carlier, 1993). Zum ADP-G-Aktin hat ß-Thymosin eine 100-fach schwächere Affinität und
bindet es damit unter zytosolischen Bedingungn praktisch überhaupt nicht. Profilin bindet
ADP-G-Aktin zwar nur mit einer Kd von ca. 3,7 µM, katalysiert dabei aber den Umtausch des
ADP zu ATP (Goldschmidt-Clermont et al., 1992). An ß-Thymosin gebundenes ATP-G-
Aktin kann nicht polymerisieren und ist auf diese Weise der Dynamik des Aktin-Zytoskeletts
entzogen (Weber et al., 1992; Yu et al., 1993). Profilin-gebundenes ATP-G-Aktin könnte am
„Plus“-Ende der Aktinfilamente binden, aber da diese in vivo an ihren „Plus“-Enden mit Cap-
70

Diskussion
ping-Proteinen überwiegend geschützt sind, bildet es dadurch einen Pool unpolymerisierten
Aktins. Auf diese Weise wird die Verlängerung der Aktinfilamente gehemmt. Auf der ande-
ren Seite ist dieser Pool eine Quelle für ATP-G-Aktin, das bei Änderungen physiologischer
Bedingungen für die Polymerisation bereits vorliegt. Die V-ATPase Untereinheit C bindet
ebenfalls an Aktin-Monomere. Dabei unterscheidet sie kaum zwischen ATP- und ADP-Aktin
und bindet beide Formen mit einer sehr hohen Affinität (Kd = 0,52 µM für ATP-Aktin bzw.
0,62 µM für ADP-Aktin). Ähnlich zum Profilin-Aktin-Komplex ist das an Untereinheit C-
gebundene ATP-G-Aktin polymerisierungsfähig und zeigte in Lichtstreuungsexperimenten
eine wesentliche Beschleunigung des Wachstums der Aktinfilamente.
Im Gegensatz zu den genannten G-Aktin-bindenden Proteinen interagiert die Unter-
einheit C auch mit Aktinfilamenten. Die Wechselwirkung mit sowohl G- als auch F-Aktin ge-
hört zu den typischen Eigenschaften der Proteine aus der ADF/Cofilin Familie (Sun et al.,
1995). Diese Proteine binden an Aktinfilamente mit einer Stöchiometrie von 1 Molekül pro 1
F-Aktin-Monomer (Nishida et al., 1984) und depolymerisieren Aktinfilamente. Die Depoly-
merisierung scheint durch den pH-Wert reguliert zu werden: bei einem pH von 7,5 bis 8,5 zer-
legen die ADF/Cofiline die Aktinfilamente schnell und vollständig, während sie bei relativ
niedrigen pH-Werten von 6,0 bis 7,5 diese Aktivität verlieren und ganz im Gegensatz sehr
stabil an Aktinfilamente binden (Yonezawa et al., 1985). Ähnlich wie die ADF/Cofiline bin-
det die Untereinheit C an Aktinfilamente mit einer Stöchiometrie von 1 zu 1. Dieser Wert
scheint vertrauenswürdig zu sein, da die Co-Pelletierungsversuche unter reduzierenden Be-
dingungen durchgeführt wurden und somit die Untereinheit C nur als Monomer vorliegen
konnte. Im Gegensatz zur Situation bei den ADF/Cofilinen hatten pH-Änderungen von 6,0
bis 8,5 keinen Einfluss auf die Eigenschaften der Untereinheit C, was bedeutet, dass sie kei-
nerlei Aktin-Depolymerisierungs-Aktivität aufwies; ganz im Gegensatz stabilisierte die Un-
tereinheit C die Aktinfilamente bei jedem getesteten pH-Wert.
Die Eigenschaft der Untereinheit C, Aktinfilamente zu bündeln, kann grundsätzlich
durch ihre zwei Aktinbindungsstellen erklärt werden. Da sie ein langestrecktes Molekül ist
(Armbrüster et al., 2004), dessen N- und C-Termini, wie die Röntgenstrukturanalyse mit einer
Auflösung von 0,175 nm ergab, nahe beieinander liegen und einen möglicherweise Aktin-
bindenden „Fuß“ bilden (Drory et al., 2004), erfordert dies aber, dass im mittleren Bereich des
Moleküls, also im Hals oder Kopf, eine zweite Aktinbindestelle vorkommt. Dies kann zur
Zeit weder bestätigt noch ausgeschlossen werden. Die Bündelung von Aktinfilamenten kann
aber grundsätzlich auch über oligomerisierte C-Untereinheiten erfolgen. In einem solchen Fall
71

Diskussion
ergibt sich auch die Möglichkeit variabler Abstände der Aktinfilamente sowie einer dreidi-
mensionalen Vernetzung der Filamente.
Die ADF/Cofiline haben zwar nur eine Aktin-Bindungsstelle, aber sie sind auch fä-
hig, Dimere und Oligomere zu bilden. Dabei zeigen entstehende Dimere und Oligomere die
Tendenz, Aktinfilamente zu vernetzen (Pfannstiel et al., 2001). Die Vernetzungsfähigkeit mit
Aktinfilamenten ist die einzige und deswegen prominente Funktion weiterer sogenannter
Crosslinking-Proteine. Unter diesen Proteinen gibt es solche wie Fimbrin, welche zwei Aktin-
Bindungsstellen besitzen und solche wie α-Aktinin, welche zwar nur eine Aktin-
Bindungsstelle haben, aber nach Dimerisierung Aktinfilamente vernetzen (Ayscough, 1998).
Die Art und Weise, wie Aktinfilamente gebündelt werden, hängt von den konkreten Eigen-
schaften eines Crosslinking-Proteins ab. So strukturiert beispielweise das 68 kDa-große
Fimbrin die Aktinfilamente in straffe parallele Bündel mit einem Abstand zwischen den Fila-
menten von ca. 14 nm (Matsudaira et al., 1983). Wenn die mit einer Länge von ca. 10 nm
(Drory et al., 2004) langgestreckte V-ATPase Untereinheit C Aktin-Bindungsstellen am
Kopf- und Fußteil besitzt, würde dies zu ähnlich straffen Bündeln führen.
Abb.34 Regulation der Abstände zwischen den Aktinfilamenten bei Bündelung mit α-Aktinin
(nach Meyer and Aebi, 1990).
72

Diskussion
Dimere des 100 kDa großen α-Aktinins packen Aktinfilamente in Bündel, und der
Abstand zwischen den Aktinfilamenten wird durch verschiedene sekundäre Faktoren wie
Temperatur, Mg 2+ -Konzentration usw. reguliert (Meyer and Aebi, 1990) (Abb. 34).
Dimere eines anderen Crosslinking-Proteins, nämlich des Filamins (Monomer: 270
kDa), vernetzen Aktinfilamente überwiegend unter einem rechtem Winkel und sorgen vor al-
lem für die maschenähnlichen Strukturen im Aktin-Zytoskelett (Matsudaira, 1994; van der
Flier and Sonnenberg, 2001). Ähnliches könnte auch auf den Fall der Untereinheit C zutref-
fen, wenn diese Dimere oder/und Oligomere bildet.
5.4. Aktin-Bindungsstellen der Untereinheit C
Die Vielfalt Aktin-bindender Proteine entstand offensichtlich durch Mutationen und
Genduplikationen relativ weniger Aktin-Bindungsmotive (Lappalainen et al., 1998), wobei
die Calponin-Homologie-Domäne, die ß-Thymosin-ähnliche Domäne, die Gelsolin-
Homologie-Domäne und die ADF/Cofilin-Homologie-Domäne die meist verbreiteten Motive
sind.
Die Calponin-Homologie-Domäne (ca. 110 Aminosäuren) ist ein typisches Motiv,
das in Crosslinking-Proteinen wie Fimbrin, α-Aktinin, Dystrophin, Spectrin, Cortexillin ver-
treten ist (Banuelos et al., 1998; Hartwig, 1994; Puius et al., 1998). Die hoch konservierte ß-
Thymosin-Domäne von etwa 5 kDa stellt das kleinste der Aktin-bindenden Motive dar (Van
Troys et al., 1999). Sogenannte Severing-Proteine, die an Aktinfilamente binden, sie brechen
und schließlich häufig das neu entstehende „Plus“-Ende durch „Capping“ schützen, oder die
typischen Capping-Proteine, die keine Aktivität besitzen, Aktinfilamente zu brechen, haben in
ihrer Struktur drei bis sechs Gelsolin-Homologie-Domänen à 15 kDa (Matsudaira and Jan-
mey, 1988; Puius et al., 1998; Weeds and Maciver, 1993). Zu den genannten Gruppen gehö-
ren z.B. Proteine wie Gelsolin, Severin, Villin, Fragmin, Adseverin oder Scinderin (Puius et
al., 2000). Die ADF/Cofilin-Homologie-Domäne ist grundsätzlich die einzige Klasse der Ak-
tin-Bindungsmotive, die sowohl G- als auch F-Aktin bindet. Damit erfüllt sie eine der wich-
tigsten Eigenschaften der Untereinheit C. Die Aktin-Depolymerizations-Faktoren (ADF) und
die Cofiline sind etwa 13-20 kDa groß (Bamburg, 1999) und enthalten nur eine Aktin-
bindende Domäne. Das kleinste Mitglied dieser Familie ist das ADF aus Toxoplasma gondii,
welches aus nur 118 Aminosäureresten (13 kDa) besteht und nur die hochkonservierten Be-
reiche enthält (Allen et al., 1997). Es gibt aber auch eine Gruppe von Proteinen, die zwei
73

Diskussion
ADF/Cofilin-Homologie-Domänen besitzen (Lappalainen et al., 1998), die sogenannten
Twinfiline. Sie sind etwa 40 kDa große G-Aktin-bindende Proteine, die Aktinfilamente weder
depolymerisieren noch überhaupt an sie binden können (Ojala et al., 2002; Wahlström et al.,
2001).
Um Muster einer der bekannten Aktin-bindenden Domänen in einem Protein zu er-
kennen, sollte die sekundäre und tertiäre Struktur dieses Proteins unbedingt bekannt sein, da
große Unterschiede in den Aminosäuresequenzen bestehen können. So weisen zum Beispiel
die Primärstrukturen der Vertreter der ADF/Cofilin-Familie aus verschiedenen Tierarten z.T.
Identitäten von nur 20-30 % auf (Bamburg, 1999), besitzen aber in einem bestimmten Bereich
die gleiche dreidimensionale Anordnung einer α-Helix und eines ß-Faltblatts (Lappalainen et
al., 1998).
In Hinblick auf die V-ATPase Untereinheit C ist nur die der Hefe bisher kristallisiert
und, wie schon erwähnt, mit einer Auflösung von 0,175 nm analysiert worden (Drory et al.,
2004). Das längliche Protein besteht zu ca. 64 % aus α-helicalen Strukturen (Armbrüster et
al., 2004) und besitzt, wie ebenfalls schon erwähnt, drei Domänen, nämlich einen Fuß-, einen
Hals- und einen Kopfteil (Drory et al., 2004). Kopf und Fuß haben beide eine globuläre Form,
bestehen jeweils aus vier antiparalellen β-Faltblättern und zwei dazwischen liegenden α-
Helices und sind durch einen länglichen Hals, der im Wesentlichen aus zwei sehr langen anti-
parallelen α-Helices besteht, miteinander verbunden. Die Autoren diskutieren eine gewisse
dreidimensionale Ähnlichkeit eines Teils des Fußes mit Gelsolin. Leider zeigt die Unterein-
heit C der Bäckerhefe nur etwa 35 % Identität und etwa 56 % Ähnlichkeit zur Untereinheit C
aus Manduca. Außerdem wurde bei der Hefe bisher keine Interaktion zwischen der V-ATPase
und Aktinfilamenten nachgewiesen (Xu and Forgac, 2001). Zukünftige Untersuchungen soll-
ten diese Frage klären.
Der Vergleich der Aminosäuresequenz der V-ATPase Untereinheit C aus Manduca
mit den Aminosäurensequenzen typischer Aktin-bindender Proteine führte nicht zur Detektion
einer der oben beschriebenen Aktin-bindenden Domänen. Nur sehr kurze Abschnitte der Un-
tereinheit C zeigten eine gewisse Ähnlichkeit zu Aminosäurensequenzen von Proteinen wie
Cofilin, Fimbrin oder α-Aktinin. Diese eher negativen Befunde sind daher noch kein Grund,
weitere Spekulationen über mögliche Aktin-bindende Motive anzustellen.
Die Gehirn- und Nieren-Isoformen der humanen V-ATPase Untereinheit B enthalten
eine elf Aminosäuren lange Sequenz, die kürzlich als Profilin-ähnliches Aktin-bindendes Mo-
tiv bezeichnet wurde (Chen et al., 2004). Die Autoren konnten zeigen, dass das entsprechende
74

Diskussion
Motiv mit Aktinfilamenten interagiert und dass es sich Profilin gegenüber kompetitiv in der
Aktinbindung verhält. Passend dazu zeigte eine heterolog exprimierte Untereinheit B mit ei-
nem Spacer an Stelle der Profilin-ähnlichen Sequenz keine Aktin-Bindung. Der Profilin-
ähnliche Abschnitt existiert auch in den B-Untereinheiten anderer Organismen inklusive
Manduca (Abb. 35).
Die V-ATPase Untereinheit C aus Manduca besitzt ebenfalls einen Bereich, der nicht
nur zu 55 % identisch mit dem Profilin-ähnlichen Motiv der humanen Untereinheit B ist, son-
dern auch ein für die Aktin-Bindung essentielles Phenylalanin enthält (Abb. 35). Diese Stelle
entspricht den Aminosäuren 276-286 der Untereinheit C aus Manduca und könnte eventuell
für die Interaktion ihrer C-terminalen Hälfte mit Aktin verantwortlich sein. In diesen 11 Ami-
nosäuren ist die Untereinheit C aus Manduca zu 100 % identisch mit der Untereinheit C von
Insekten wie Anopheles gambiae und Drosophila melanogaster oder von Säugetieren wie
Homo sapiens, Mus musculus und Bos taurus. Die entsprechenden Bereiche der Aminosäure-
sequenzen aus Arabidopsis taliana und Saccharomyces cerevisiae zeigen dagegen nur 27 %
bzw. 18% Identität gegenüber Manduca, wobei auch noch das für die Interaktion mit Aktin
entscheidende Phenylalanin fehlt. Dies impliziert, dass die V-ATPase Untereinheit C aus
Pflanzen oder Hefen möglicherweise nicht oder aber über andere Domänen mit dem Aktin-
Zytoskelett interagiert. Auch diese Frage müssen zukünftige Untersuchungen klären.
Untereinheit B Untereinheit C
Homo sapiens
55 GPLVILDHVKF 277 GPLVRWLKVNF
Manduca sexta
38 GPLVILDEVKF 276 GPLVRWLKVNF
Caenorhabditis elegans
37 GPLVILNDVKF 279 APLIRWLKINF
Arabidopsis taliana
28 GPLVILEKVKG 276 SSLLQWCYTSY
Saccharomyces cerevisiae
36 GPLVILEKVKF 286 VQLVRLAKTAY
Abb.35 Profilin-ähnliches Motiv in den V-ATPase Untereinheiten B und C.
75

Diskussion
5.5. Biologische Rolle der Untereinheit C
Obwohl ihre cDNA schon vor nahezu eineinhalb Jahrzehnten kloniert worden war
(Nelson et al., 1990), bleibt die Funktion der Untereinheit C bis heute nicht gut verstanden.
Das mag daran liegen, dass es, im Gegensatz zu den Untereinheiten A, B oder dem Proteoli-
pid, für die Untereinheit C der V-ATPasen kein Pendant bei den F-ATPasen gibt (Nelson,
1989; Nelson and Taiz, 1989).
Ähnlich wie einige andere Untereinheiten der V-ATPase wird die Untereinheit C der
Hefe von einem einzelnen Gen kodiert (Hirata et al., 1990; Kane et al., 1989; Nelson and Nel-
son, 1989). Die Maus hingegen verfügt über zwei Gene für die Untereinheit C, C1 und C2;
das Produkt des C1-Gens ist ein ubiquitäres Protein und wird überall exprimiert, das Produkt
des C2-Gens ist dagegen nur in Lunge und Niere zu finden (Sun-Wada et al., 2003a). Inzwi-
schen weiß man, dass durch alternatives mRNA-Spleißen zwei Varianten der Untereinheit C2
entstehen können. Die C2a-Untereinheit befindet sich in der Lunge, die C2b-Untereinheit ist
in der Niere lokalisiert. In Hefezellen heterolog exprimierte C2a- oder C2b-Isoformen führen
zu niedrigeren Km(ATP)-Werten der V-ATPase (126 bzw. 110 µM) und einem schwächeren
Protonentransport als die heterolog exprimierte C1-Untereinheit mit einer Km(ATP) von 194
µM oder die intrinsische Hefe-Untereinheit C, Vma5p, mit einer Km(ATP) von 192 µM (Sun-
Wada et al., 2003b). Allgemein ist die V-ATPase Untereinheit C ein relativ gut konserviertes
Protein. So ist die Aminosäurensequenz aus Manduca bis zu 56 % bzw. 35 % identisch mit
der der Untereinheit C aus H. sapiens bzw. S. cerevisia.
Assoziations-Studien mit der V-ATPase aus Clathrin-Vesikeln des Rinderhirns zeig-
ten, dass die Untereinheit C nicht essentiell für die Assoziation anderer Untereinheiten zum
V1-Komplex ist und dass ihre Abwesenheit weder die Assoziation von V1- und Vo-
Komplexen noch den Protonentransport verhindert; vielmehr ist sie für die Stabilität und ma-
ximale Aktivität des V-ATPase-Holoenzyms verantwortlich (Puopolo et al., 1992). Für die
Stabilität der V-ATPase sind kleine Bereiche im C-Terminus der Untereinheit C verantwort-
lich, wie Mutationsexperimente mit der Hefe zeigten (Curtis et al., 2002). Fehlt die Unterein-
heit C, fällt die Enzymaktivität um ca. 50 %. Außerdem verhält sich die V-ATPase ohne Un-
tereinheit C labil gegenüber Detergenzien oder auch bei der Immunpräzipitation (Puopolo et
al., 1992). Immunpräzipitationsversuche mit Hefemutanten bestätigten die Aussage, dass die
Untereinheit C für das Entstehen des V1-Komplexes nicht benötigt wird (Doherty and Kane,
1993). Resultate anderer Versuche mit der V-ATPase aus der Hefe scheinen hingegen in ei-
76

Diskussion
nem gewissen Widerspruch zu den obigen Ergebnissen zu stehen. So führte die Ausschaltung
des VMA5-Gens zum Entstehen von Zellen mit typischem V-ATPase Null (VMA - )-Phänotyp,
die bei pH 7 nicht lebensfähig waren. In der Vakuole der VMA5∆-Hefen wurde keine V-
ATPase Aktivität nachgewiesen und es wurden auch kaum V1-Komplexe an der Membran de-
tektiert (Beltran et al., 1992; Ho et al., 1993). Auf jeden Fall bestätigen die geschilderten Be-
funde die essenzielle Rolle der Untereinheit C für eine voll funktionsfähige V-ATPase.
Die Injektion der Untereinheit C-siRNA in Tabakschwärmerraupen führte zur Ver-
zögerung des Wachstums und, als Folge, der Entwicklung der Raupen. Die Immunfärbung
von Gefrierschnitten detektierte einen deutlichen Unterschied in der Zahl und Größe der
Gobletzellen zwischen behandelten Raupen und Tieren aus der Kontrollgruppe. Der Mittel-
darm der behandelten Raupen enthielt nicht nur weniger Gobletzellen insgesamt, sondern die
Goblets selbst sahen eindeutig kleiner aus. Mit anderen Worten: die gesamte Oberfläche der
Gobletzell-Apikalmembranen war bei behandelten Raupen wesentlich kleiner als bei unbe-
handelten Tieren. Dies sollte logischerweise die Nahrungsaufnahme und damit das Wachstum
der Raupen hemmen. Obwohl die genauen Mechanismen, die zu den betrachteten Phänome-
nen führen, unbekannt bleiben, ist klar, dass die Untereinheit C für das rechtzeitige Entstehen
von funktionsfähigen Gobletzell-Apikalmembranen im Mitteldarm von Manduca unbedingt
notwendig ist.
Die Untereinheit C ist einzige V-ATPase Untereinheit, die sich vom V1-Komplex bei
seiner Dissoziation vom Vo-Komplex trennt und frei im Zytosol vorkommt. Dabei kann sie,
wie in dieser Arbeit berechnet, in den Gobletzellen von Manduca eine Konzentration von bis
zu 10 µM erreichen. Ein solch hoher Gehalt im Zytosol macht die Untereinheit C zu einem
hervoragenden Kandidaten für die Wechselwirkung mit anderen Proteinen und damit gegebe-
nenfalls auch für die Regulation der V-ATPase-Aktivität. So wurde in dieser Arbeit gezeigt,
dass die Untereinheit C mit Proteinkinase A und mit Aktin interagiert. Die Phosphorylierbar-
keit der Untereinheit C verstärkt die Möglichkeit einer Schlüsselrolle der Untereinheit C bei
der Kontrolle verschiedener Prozesse in der Zelle.
Die Fähigkeit zur Interaktion mit Aktin weist auf eine möglicherweise bedeutende
Rolle der Untereinheit C für die Dynamik des Aktin-Zytoskeletts in der Zelle hin. Die Unter-
einheit C bindet sowohl monomeres Aktin als auch Aktinfilamente, wobei sie nicht zwischen
dem ATP- und dem ADP-Zustand des Aktins und damit zwischen den „Plus“- und „Minus“-
Enden der Filamente unterscheidet. Dies und die nachgewiesene Aktivität, Aktinfilamente zu
77

Diskussion
vernetzen, weist die Untereinheit C als einen hervorragenden Kandidaten für das Crosslinking
der Aktinfilamente in den Mikrovilli und im apikalen terminalen Netz der Gobletzellen aus.
5.6. Phosphorylierung der Untereinheit C: Fakten und Spekulationen
Die posttranslationale Modifizierung von Proteinen durch Phosphorylierung gehört
zu den prinzipiellen regulatorischen Mechanismen der Zelle (Rubin and Rosen, 1975). Bei der
Phosphorylierung wird eine Phosphatgruppe auf eine Aminosäureseitenkette des Proteins
übertragen. Ein Protein kann an mehreren bis vielen Stellen phosphoryliert werden. Durch die
Phosphorylierung erhält das Protein eine stärkere negative Ladung, wobei sich in der Regel
seine räumliche Struktur verändert. So können Enzyme aktiviert oder gehemmt (Holzer and
Duntze, 1971; Segal, 1973), Ionenkanäle geöffnet oder geschlossen (Davis et al., 2001; Gao et
al., 1997; Nelson and Quayle, 1995; Warn-Cramer and Lau, 2004), Interaktionen zwischen
Proteinen verstärkt oder geschwächt sowie die Transkription und die Translation reguliert
werden (Allfrey et al., 1974; Fasy et al., 1979; Stein and Baserga, 1972; Stein et al., 1974).
Phosphorylierung ist ein reversibler Prozess, wobei die Dephosphorylierung von ver-
schiedenen Phosphatasen katalysiert wird. Auf diese Weise stellt die Phosphorylierung einen
hervorragenden Mechanismus für die Regulation verschiedener Lebensprozesse sowohl bei
Eukaryoten als auch bei Prokaryoten dar. Bei Bakterien unterscheidet man drei prinzipielle
Phosphorylierungssysteme: Sensor-Kinase/Response-Regulator-System, Phosphoenolpyru-
vat:Zucker-Phosphotransferase System und ein System, bei dem ATP-abhängige Proteinkina-
sen beteiligt sind (Saier, 1993). In den beiden ersten Fällen werden Histidin- oder Aspar-
tatreste der Proteine phosphoryliert, die Proteinkinasen dagegen übertragen die Phosphat-
gruppe auf Serin, Threonin oder Tyrosin.
Proteine von Eukaryoten werden grundsätzlich nur mit Hilfe von Proteinkinasen
phosphoryliert. Die Proteinkinasen der Eukaryoten sind unglaublich vielfältig. So wurden bei-
spielweise bei Vertebraten über 800 verschiedene Gene für Proteinkinasen nachgewiesen.
Funktionell werden alle eukaryotischen Proteinkinasen in zwei große Klassen eingeordnet, die
Serin-/Threoninkinasen und die Tyrosinkinasen; es gibt aber auch Berichte über Proteinkina-
sen, die sowohl Tyrosine als auch Serine und Threonine phosphorylieren können (Lindberg et
al., 1992).
Ein klassisches Beispiel für Tyrosinkinasen stellen die Rezeptor-Tyrosinkinasen dar.
Die Bindung von Signalmolekülen wie Insulin oder verschiedenen Wachsturmhormonen führt
78

Diskussion
dabei zur Autophosphorylierung von Tyrosinen im zytosolischen Teil. Die phosphorylierten
Rezeptor-Tyrosinkinasen sind aktiv und phosphorylieren viele Proteine, daunter auch andere
Proteinkinasen.
Unter den Proteinkinasen, die Serine und Threonine phosphorylieren, sind die Prote-
inkinasen A und C am besten untersucht (Pollard and Earnshaw, 2002). Proteinkinase C
(PKC) bindet durch die Interaktion mit Diacylglycerol an die Membran und wird dadurch ak-
tiviert, wobei bei vielen Mitgliedern dieser Familie die Bindung von Ca 2+ an einen zweiten
regulatorischen Bereich für die Aktivierung notwendig ist. Diacylglycerol entsteht bei der
durch Phopholipase C katalysierten Spaltung von Phospholipiden. Die angeschaltete PKC ak-
tiviert u.a. die sogenannten MARCKS-Proteine (myristiliertes Alanin-reiches C-Kinase Sub-
strat), die über ein Lipidmolekül in der Zellmembran verankert sind (Blackshear, 1993). Diese
sind an wichtigen physiologischen Vorgängen wie Zellbewegung, Sekretion, Membrantrans-
port und der Regulation des Zellzyklus beteiligt. PKC aktiviert auch eine Reihe von Ionenka-
nälen, Transkriptionsfaktoren und verschiedene Elemente des Zytoskeletts (Spitaler and
Cantrell, 2004).
Proteinkinase A (PKA) wird durch die Bindung von cAMP, das bei der Spaltung von
ATP durch Adenylatcyclase entsteht, aktiviert. PKA ist ein zytosolisches Protein und liegt als
Tetramer mit zwei regulatorischen und zwei katalytischen Untereinheiten vor. Als Tetramer
ist das Enzym inaktiv. Durch die Bindung von cAMP an die regulatorischen Untereinheiten
werden die katalytischen Untereinheiten freigesetzt und damit aktiviert (Beebe, 1994; Francis
and Corbin, 1994). Die aktivierten katalytischen Untereinheiten phosphorylieren zahlreiche
Proteine wie Transkriptionsfaktoren, Enzyme, Ionenkanäle und Komponenten des Zytoske-
letts.
Die V-ATPase Untereinheit C aus Manduca besitzt 19 Serine und 19 Threonine und
kann in vitro mit Hilfe der PKA phosphoryliert werden (Abb. 29). Erste Vorversuche, die im
Rahmen einer Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. Simone König (IZKF, Univer-
sität Münster) durchgeführt worden, weisen darauf hin, dass die Untereinheit C an drei Stellen
phosphoryliert wird (Ergebnisse nicht gezeigt). Dies passt gut zu den drei Phosphorylie-
rungsstellen, die mit Hilfe des NetPhos 2.0 Servers (Center for biological sequence analysis;
Technical University of Denmark) theoretisch berechnet wurden. So wurden das Serin an der
Position 326 und Threonine an den Positionen 212 und 333 als Phosphorylierungsstellen für
PKA vorhergesagt.
79

Diskussion
Durch die Zusammenarbeit mit den Kollegen aus Münster sollen nicht nur die
Phosphorylierungsstellen bestimmt werden, sondern auch der Zustand der Untereinheit C,
wenn sie sich frei im Zytosol befindet oder an das V-ATPase-Holoenzym gebunden ist. Die
Antworten auf diese Fragen sind von großer Bedeutung, weil sie auf physiologische Funktio-
nen der Untereinheit C hinweisen könnten. Auf der anderen Seite ist es erforderlich, dafür
auch die Affinität der phosphorylierten Untereinheit C zum V1-Komplex und zum Aktin mit
der Affinität des unphosphorylierten Proteins zu vergleichen. So könnte z.B. die Phosphory-
lierung der Untereinheit C ihre Interaktion mit Aktinfilamenten und damit (oder unabhängig
davon) die Dissoziation/Assoziation der V-ATPase kontrollieren.
Indirekte Beweise, dass die Aktivität der V-ATPase durch Phosphorylierung mit
PKA reguliert wird, liefern die Arbeiten von Kollegen aus Potsdam, die sich mit der V-
ATPase aus Speicheldrüsen von Calliphora vicina beschäftigen. Sie konnten zeigen, dass Se-
rotonin (5-Hydroxytryptamin) die Aktivität der V-ATPase annähernd verdoppelt und auf die-
se Weise die Sekretionstätigkeit der Speicheldrüsen stimuliert (Zimmermann et al., 2003). Se-
rotonin ist ein natürliches Hormon für die Speicheldrüsen (Berridge and Patel, 1968) und in-
duziert die Produktion von wichtigen sekundären Botenstoffen in der Zelle wie cAMP und
Inositol(1,4,5)-Trisphosphat (Berridge et al., 1983; Heslop and Berridge, 1980). In der Tat
führte die direkte Inkubation der Speicheldrüsen mit cAMP zur Steigerung der Aktivität der
V-ATPase infolge einer verstärkten Re-Assoziation des V1-Komplexes an den Vo-Komplex
(Bernd Walz und Otto Baumann, unpubliziert). In diesem Zusammenhang könnte die in die-
ser Arbeit nachgewiesene Phosphorylierung der Untereinheit C aus Manduca als grundsätzli-
cher regulatorischer Faktor für die reversible Dissoziation/Assoziation der V-ATPase dienen.
80

6. Zusammenfassung
Zusammenfassung
V-ATPasen kommen in jeder eukaryotischen Zelle vor, wo sie sekundär aktive
Transporte energetisieren und eine Reihe von intrazellulären Kompartimenten ansäuern. In
der vorliegenden Doktorarbeit wurde die Interaktion der V-ATPase aus Raupen des Tabak-
schwärmers Manduca sexta mit dem Aktin-Zytoskelett untersucht.
Nachdem die Co-Lokalisation der V-ATPase mit Aktinfilamenten u.a. an den apika-
len Membranen der Mitteldarm-Gobletzellen immunzytochemisch festgestellt worden war,
wurde als Erstes die direkte Wechselwirkung zwischen der V-ATPase und den Aktinfilamen-
ten durch Co-Pelletierungsstudien nachgewiesen. Die Befunde wurden sowohl mit dem V1Vo-
Holoenzym als auch mit dem V1-Komplex erzielt, wobei sich eine Stöchiometrie von einer V-
ATPase pro 4-5 F-Aktin-Monomere ergab.
Mit Hilfe von Overlayblot-Verfahren wurde gezeigt, dass sowohl die Untereinheit B
als auch Untereinheit C die Bindung an Aktin vermitteln. Co-Pelletierungsexperimente mit
rekombinanter Untereinheit C und Aktinfilamenten wiesen eine unmittelbare Interaktion zwi-
schen beiden Proteinen nach. Mit rekombinanter Untereinheit C rekonstituierter V1-Komplex
hatte eine deutlich höhere Affinität zu Aktinfilamenten als C-freier V1-Komplex.
In Overlayblots wurde nachgewiesen, dass die Untereinheit C nicht nur an filamentö-
ses F-Aktin, sondern auch an globuläres G-Aktin bindet. Die Interaktion mit G-Aktin konnte
mit NBD-markiertem Aktin quantifiziert werden, wobei sich Dissoziationskonstanten von 50-
60 nM ergaben; eine Bevorzugung von ATP-Aktin gegenüber ADP-Aktin oder umgekehrt
konnte nicht festgestellt werden.
Der Nachweis der Interaktion der Untereinheit C mit G- und F-Aktin führte zu der
Vermutung, dass die Untereinheit C die Dynamik des Aktin-Zytoskeletts beeinflussen könnte.
Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass die Untereinheit C Aktinfilamente unabhängig vom
pH stabilisiert und dass sie einen positiven Einfluss auf die Polymerisationsrate und die Ver-
netzung von Aktinfilamenten hat. Letzteres wurde deutlich durch den Nachweis, dass Aktinfi-
lamente in Gegenwart von Untereinheit C schon bei mehr als zehnfach niedrigeren Beschleu-
nigungen sedimentieren als in ihrer Abwesenheit. Auch im Fluoreszenzmikroskop konnte die
Bündelung von Aktinfilamenten durch die Untereinheit C nachgewiesen werden.
Mit Hilfe von rekombinant hergestellten Proteinen wurde die Interaktion sowohl der
aminoterminalen als auch der carboxyterminalen Hälfte der Untereinheit C mit Aktin nach-
gewiesen. Daraus konnte der Schluss gezogen werden, dass damit eine Voraussetzung für die
81

Zusammenfassung
Bündelung von Aktinfilamenten gegeben war. Auch die nachgewiesene Di- und Oligomeri-
sierung der Untereinheit C sowie die Dimerisierung ihrer N- und C-terminalen Hälften unter
oxidierenden Bedingungen könnte grundsätzlich als eine Voraussetzung für die Fähigkeit zur
Bündelung angesehen werden.
Zwei unterschiedliche Typen von Vorversuchen bildeten den Abschluss dieser Ar-
beit, Versuche zur RNA-Interferenz und der Nachweis der Phosphorylierbarkeit der Unterein-
heit C. Die Injektion von siRNA führte zu einer deutlich verringerten Wachstumsrate der
Raupen und zu phänotypischen Veränderungen in der Struktur des Mitteldarms. Mit Hilfe von
radioaktivem ATP wurde gezeigt, dass die Untereinheit C durch die Proteinkinase A
phosphoryliert werden kann. Diesem Phänomen könnte eine große Bedeutung für die Regula-
tion der Eigenschaften der Untereinheit C zukommen, da für viele Aktin-bindende Proteine
nachgewiesen ist, dass ihr Phosphorylierungsgrad eine wichtige Rolle bei der Interaktion mit
Aktin spielt.
82

7. Literaturverzeichnis
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Xu, T. and Forgac, M. (2000). Subunit D (Vma8p) of the yeast vacuolar H + -
ATPase plays a pole in coupling of proton transport and ATP hydrolysis. J Biol
Chem 275, 22075-22081.
Xu, T. and Forgac, M. (2001). Microtubules are involved in glucose-dependent dissociation
of the yeast vacuolar H + -ATPase in vivo. J Biol Chem 276, 24855-
24861.
Yonezawa, N., Nishida, E. and Sakai, H. (1985). pH control of actin polymerization
by cofilin. J Biol Chem 260, 14410-14412.
Yu, F. X., Lin, S. C., Morrison-Bogorad, M., Atkinson, M. A. and Yin, H. L.
(1993). Thymosin beta 10 and thymosin beta 4 are both actin monomer sequestering
proteins. J Biol Chem 268, 502-509.
Zhang, K., Wang, Z. Q. and Gluck, S. (1992a). Identification and partial purification
of a cytosolic activator of vacuolar H + -ATPases from mammalian kidney. J
Biol Chem 267, 9701-9705.
Zhang, K., Wang, Z. Q. and Gluck, S. (1992b). A cytosolic inhibitor of vacuolar
H + -ATPases from mammalian kidney. J Biol Chem 267, 14539-14542.
Zimmermann, B., Dames, P., Walz, B. and Baumann, O. (2003). Distribution and
serotonin-induced activation of vacuolar-type H + -ATPase in the salivary glands of
the blowfly Calliphora vicina. J Exp Biol 206, 1867-1876.
96

8. Publikationen
Originalarbeiten:
Publikationen
Vitavska, O., Wieczorek, H. and Merzendorfer, H. (2003). A novel role for sub-
unit C in mediating binding of the H + -V-ATPase to the actin cytoskeleton. J Biol
Chem. 278, 18499-18505.
Vitavska, O., Merzendorfer, H. and Wieczorek, H. (2005). The V-ATPase subunit
C binds to polymeric F-actin as well as to monomeric G-actin and induces cross-
linking of actin filaments. J Biol Chem, im Druck (Epub ahead of print, 2004 Nov 3)
Review:
Wieczorek, H., Huss, M., Merzendorfer, H., Reineke, S., Vitavska, O. and
Zeiske, W. (2003). The insect plasma membrane V-ATPase: intra-, inter-, and su-
pramolecular aspects. J Bioenerg Biomembr 35, 359-366.
97

9. Abkürzungverzeichnis
ADP: Adenosin-Diphosphat
ATP: Adenosin-Triphosphat
BCIP: 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat
BSA: Rinderserumalbumin
cAMP: zyklisches Adenosin-Monophosphat
Cy3: Indocarbocyanin
C12E10: Polyoxyethylen-10-Laurylether
DMSO: Dimethylsulfoxid
DTT: Dithiothreitol
EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
FITC: Fluorescein
kDa: Kilodalton
MES: 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
MOPS: 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure
NBT: 4-Nitroblautetrazoliumchlorid-Hydrat
NLS: N-Lauroylsarkosin
SDS: Natriumdodecylsulfat
TEMED: N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin
TRITC: Tetramethylrhodamin B Isothiocyanat
Tris: 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol
Tween 20: Polyoxyethylensorbitanmonolaureat
Triton X-10: Octylphenolpoly(ethylenglycolether)
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Abkürzungverzeichnis

100

10. Lebenslauf
Name: Vitavska
Vorname: Olga
Geburtsdatum: 15.04.1973
Geburtsort: Fastiv, Ukraine
Ausbildung:
1990 Abitur mit „ausgezeichnet“, Gymnasium in Fastiv
Lebenslauf
1991 - 1996 Studium an der Universität Kiew, Fakultät für Biologie
1996 Diplom in Biologie/Biochemie mit „ausgezeichnet“
1996 - 1998 Mitarbeiterin am Institut für Zellbiologie der
Ukrainischen Akademie der Wissenschaften in Kiew
1999 - 2000 Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Institut für Biotech-
nologie der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
9/2000 - 8/2003 Stipendiatin im Graduiertenkolleg 612 am Fachbereich
Biologie/Chemie der Universität Osnabrück. Seit Febru-
ar 2001 Doktorarbeit mit dem Thema „Wechselwirkun-
gen der V-ATPase von Manduca sexta mit dem Aktin-
Zytoskelett“
ab 9/2003 Wissenschaftliche Mitarbeiterin im SFB 431 am Fachbe-
reich Biologie/Chemie der Universität Osnabrück
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102

11. Danksagung
Ich möchte mich sehr herzlich bedanken bei:
Danksagung
Prof. Dr. Helmut Wieczorek für die Betreuung meiner Doktorarbeit. Dies betrifft die
theoretische und praktische Einführung in die verschiedenen Methoden genauso wie die vie-
len intensiven Diskussionen, die zum Fortgang dieser Arbeit beigetragen haben;
Prof. Dr. Karlheinz Altendorf und apl. Prof. Dr. Henning Scholze für die Begutach-
tung meiner Doktorarbeit;
Dr. Hans Merzendorfer für die Mit-Betreuung in der ersten Hälfte der Doktorarbeit,
v.a. für die Einführung in die Fluoreszenzmikroskopie, in die Co-Pelletierungs- und Over-
layblot-Verfahren sowie in die Herstellung der rekombinanten amino- und carboxyterminalen
Hälften der Untereinheit C. Vielen Dank auch für die Überlassung des Materials für die Ab-
bildungen 3, 5 und 32;
Dr. Markus Huss für die Überlassung von transformierten E.coli-Zellen, die die
cDNA für die rekombinante Untereinheit C enthalten, sowie für gereinigte polyklonale Anti-
körper für diese Untereinheit;
Ulla Mädler für die Hilfe bei der Immunzytochemie von Gefrierschnitten;
PD Dr. Thomas Krüppel für seine geduldige Hilfe bei Software- und Hardware-
Problemen aller Art;
Martin Dransman, Harald Mikoleit, Heiko Meyer und Dr. Stephan Reineke für viel-
seitige Hilfe im Laboralltag;
Prof. Dr. Brigitte Jockusch und ihrer technischen Mitarbeiterin Sabine Buchmeyer
für die Herstellung des monoklonalen Antikörpers gegen die Untereinheit C;
Dr. Simone König und Martin Zeller für die bisher durchgeführten Experimente zur
Identifizierung der Phosphorylierungsstellen der Untereinheit C;
und last but not least allen Mitarbeitern der Abteilung Tierphysiologie für das ange-
nehme Arbeitsklima.
103

104

12. Erklärung über die Eigenständigkeit der erbrachten
wissenschaftlichen Leistung
Eidesstattliche Erklärung
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter
und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus ande-
ren Quellen direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter Angabe der
Quelle gekennzeichnet. Weitere Personen waren an der inhaltlichen materiellen Erstellung der
vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich hierfür nicht die entgeltliche Hilfe
von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder andere Personen) in An-
spruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar geldwerte Leistungen für
Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher
Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
.................................................. ...................................................
(Ort, Datum) (Olga Vitavska)
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