Wechselwirkungen der V-ATPasevon Manduca sexta mit dem Aktin ...

Ergebnisse
Demnach könnte die C-Untereinheit als eine zusätzliche Bindungsstelle die Interak-
tion des V1Vo-Holoenzyms mit F-Aktin verstärken. Um diese Hypothese zu prüfen, wurden
V1-Komplexe mit und ohne Untereinheit C hergestellt (Abb. 8A).
Die beiden durch die An- bzw. Abwesenheit von Untereinheit C sich unterscheiden-
den V1-Komplexe wurden mit Aktinfilamenten inkubiert und dann co-pelletiert. Bei jeweils
gleichen Konzentrationen ging immer deutlich mehr vom V1 Komplex, der die Untereinheit C
enthielt, zusammen mit Aktin ins Pellet (Abb. 8B). Die Quantifizierung der V-ATPase in den
Pellets per Amidoschwarz-Proteinbestimmung verdeutlichte diese Aussage und belegt damit,
dass die Affinität der V1-ATPase für F-Aktin durch die Anwesenheit von Untereinheit C deut-
lich verstärkt wird (Abb. 8C).
4.2. Interaktion der Untereinheit C mit F- und G-Aktin
4.2.1. Nachweis der freien Untereinheit C im Zytosol von Tabakschwärmerraupen
Beim Hungern oder während der Häutung der Raupen dissoziiert der V1-Komplex
vom membrangebundenen Vo-Komplex (Sumner et al., 1996; Gräf et al., 1996). Dabei verliert
der V1-Komplex die Untereinheit C (Kane, 2000; Wieczorek et al., 2000), die damit wie der
V1-Komplex frei im Zytosol vorkommt. Da freie zytosolische V1-Komplexe, wenn auch in
geringerer Konzentration, bei fressenden Raupen ebenfalls vorkommen, erhob sich die Frage,
ob dies auch für die Untereinheit C gelten würde. Um in einem zytosolischen Extrakt freie
Untereinheit C von an den V1-Komplex gebundener Untereinheit C zu unterscheiden, wurde
zunächst geprüft, wie sich die rekombinante Untereinheit C in einem Saccharose-Gradienten
verteilt. Nach einer Zentrifugation in einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten war die
rekombinante Untereinheit C hauptsächlich in der 10 %-Fraktion zu finden (Abb. 9).
Abb.9 Verteilung der Untereinheit C im Saccharosedichtegradienten. Etwa 210 µg rekombinante Untereinheit
C in LOM wurde auf einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten (3 ml 40 %, 2 ml 30 %, 2 ml 20 %
und 1,6 ml von 10 % Saccharose in TEM mit 0,2 M NaCl) aufgetragen und 90 min bei 310.000 x g und 4°C
(VTi 65.1, Beckman) zentrifugiert. Dann wurde der Gradient 1 ml-weise aliquotiert und Proben der Fraktionen
mittels SDS-PAGE und Coomassie-Färbung analysiert.
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