Wechselwirkungen der V-ATPasevon Manduca sexta mit dem Aktin ...

Methoden
Tab.2b. Verwendete sekundäre Antikörper
Sekundäre Antikörper Verdünnung
Alkalische Phosphatase-konjugierte Anti-Maus IgG 1:10.000
Alkalische Phosphatase-konjugierte Anti-Kaninchen IgG 1:10.000
Alkalische Phosphatase-konjugierte Anti-Meerschweinchen IgG 1:30.000
3.1.14. Overlayblot mit G- und F-Aktin
Dieses Verfahren ermöglicht es, schnell und relativ sicher die potenzielle Interaktion
von Proteinen zu überprüfen. Im vorliegenden Fall wurde der erste Interaktionskandidat
(V1Vo-Holoenzym, V1-ATPase oder Untereinheit C) mittels Western Blot-Verfahren oder
Slotblot-Technik auf eine Blotmembran übertragen. Um unspezifische Bindungsstellen zu
blockieren, wurde die Membran 1 Stunde bei Raumtemperatur in Blockpuffer gebadet. Da-
nach folgte eine einstündige Inkubation mit dem zweiten Interaktionskandidaten (2 µM F-
Aktin oder 2 µM G-Aktin) in Verdünnungspuffer. (F-Aktin-Herstellung: 10 µM G-Aktin
wurde durch Zugabe 10-fach konzentrierten F-Puffers 1 Stunde bei Raumtemperatur polyme-
risiert, mit 10 µM Phalloidin 15 Minuten stabilisiert und mit dem Verdünnungspuffer entspre-
chend verdünnt. G-Aktin-Herstellung: 10 µM G-Aktin wurde mit Verdünnungspuffer 4-fach
verdünnt, auf Eis 30 Minuten inkubiert und 1 Stunde bei 100.000 x g und 4°C abzentrifugiert.
Der den G-Aktin enthaltende Überstand wurde nach Bedarf mit dem Verdünnungspuffer wei-
ter verdünnt.) Nach dreimaligem Waschen (je 5 Minuten) der Membran in TTBSN-Puffer
wurde gebundenes Aktin mit einem der anti-Aktin-Antikörper detektiert.
3.1.15. Co-Präzipitation des zytosolischen Aktins mit rekombinanter Untereinheit C
Um zu überprüfen, ob die rekombinante Untereinheit C auch mit dem Aktin aus
Manduca reagiert, wurde eine Co-Präzipitazion durchgeführt. Dafür wurde die rekombinante
Untereinheit C an Affi-Gel 10-Kügelchen (Biorad) kovalent gekoppelt. Die Kopplung erfolgte
nach dem Protokoll des Herstellers und startete mit dem dreimaligen Waschen des Affi-Gels
in eiskaltem Wasser und schließlich der Äquilibrierung in 0,1 M MOPS-NaOH (pH 7,5). 0,2
ml Affi-Gel wurde mit ca. 2 ml Untereinheit C (0,1 mg/ml) in 0,1 M MOPS-NaOH (pH 7,5),
9,6 mM ß-Mercaptoethanol und 0,01 % C12E10 über Nacht bei 4°C und langsamem Rotieren
inkubiert. Nicht gekoppelte Untereinheit C wurde durch Waschen mit MOPS-Puffer entfernt.
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