Wechselwirkungen der V-ATPasevon Manduca sexta mit dem Aktin ...

Ergebnisse
Abb.11 G-Aktin-Pool im Zytosol des Mitteldarms von Tabakschwärmerraupen. Mitteldärme von fressenden
Raupen wurden in F-Puffer mit 5 mM Pefabloc SC mit einem Glashomogenisator (Wheaton) vorsichtig
homogenisiert, um die Aktinfilamente nicht zu zerstören. Nach Entfernung der Aktinfilamente sowie der Membranen
durch eine Zentrifugation von 60 min bei 200.000 x g und 4°C wurde der Überstand auf ein SDS-Gel aufgetragen.
Nach SDS-PAGE eines Aliquots des Überstandes wurden die Proteine auf eine Nitrocellulose-
Membran übertragen und dann eine Immunfärbung mit polyklonalem Antiserum gegen Aktin durchgeführt. 1,
Färbung mit Ponceau S. 2, Immunfärbung.
Das Ergebnis ließ allerdings keinen Rückschluss darauf zu, dass ein G-Aktin-Pool in
allen Zelltypen der Mitteldarm-Präparation, in der sich nicht nur Gobletzellen, sondern v.a.
Columnarzellen und ein wenig quergestreifte Muskulatur befand, vorkommt. Trotzdem pro-
vozierte der Befund die Idee, dass die Untereinheit C i den Gobletzellen möglicherweise auch
mit G-Aktin wechselwirken könnte. Dies wurde mittels eines Overlayblots mit G-Aktin über-
prüft. Die rekombinante Untereinheit C, Aldolase als eine positive Kontrolle für F-Aktin-
Bindung und BSA als eine Kontrolle für unspezifische Protein-Protein-Interaktion wurden
mittels der Slotblot-Technik auf zwei Nitrocellulosemembranen aufgetragen. Mit einer
Membran wurde ein Overlay mit G-Aktin durchgeführt, die andere wurde zur Kontrolle mit
F-Aktin behandelt.
Abb.12 Im Overlayblot reagiert die Untereinheit C sowohl mit F- als auch mit G-Aktin. Rekombinante
Untereinheit C, Aldolase als eine positive Kontrolle für F-Aktin-Bindung und BSA als eine Kontrolle für unspezifische
Interaktion wurden mittels Slotblot-Technik auf eine Nitrocellulose-Membran aufgetragen und damit ein
Overlayblot mit F-Aktin bzw. G-Aktin durchgeführt. Das gebundene Aktin wurde mit einem monoklonalen Antikörper
gegen Aktin (A 4700) nachgewiesen.
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