Wechselwirkungen der V-ATPasevon Manduca sexta mit dem Aktin ...

Ergebnisse
Die Bindung war abhängig von der Konzentration der Untereinheit C und ging bei
etwa 0,6 µM in Sättigung. Damit konnte die Interaktion der Untereinheit C mit Aktinfilamen-
ten endgültig bestätigt werden. Durch einen Proteintest wurde bestimmt, dass etwa 0,2 µM
Untereinheit C mit 0,2 µM Aktin im Sättigunsbereich co-pelletiert (Abb. 6B), was auf eine
1:1-Stöchiometrie schließen lässt.
4.1.5. Untereinheit C interagiert mit F-Aktin aus Manduca
Wie schon gezeigt wurde, reagierte sowohl die Untereinheit C im V1Vo-Holoenzym
als auch die rekombinante Untereinheit C mit F-Aktin aus Kaninchenmuskel. Trotz der hohen
Ähnlichkeit zum Nicht-Muskel-Aktin aus Tabakschwärmerraupen (EMBL/GenBank) wurde
die Spezifität der Bindung mit Aktin aus Manduca zusätzlich überprüft. Dafür wurde die an
Affi-Gel-Kügelchen kovalent gekoppelte rekombinante Untereinheit C mit zytosolischem Ex-
trakt aus Manduca inkubiert. Als positive Kontrolle wurde die gleiche Menge der gekoppelten
Untereinheit C mit Kaninchenmuskel-Aktin inkubiert. Nach SDS-PAGE und Western Blot
zeigte schon die Anfärbung der Membran mit Ponceau S eine deutliche Bande im Bereich des
Aktins. Die folgende Immunfärbung mit dem polyklonalen Antiserum gegen Aktin bestätigte
diese Vermutung (Abb. 7).
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Abb.7 Co- Präzipitation des Aktins aus Manduca mit der Untereinheit C. Die an Affi-Gel 10 gekoppelte
rekombinante Untereinheit C wurde mit dem zytosolischen Extrakt aus Manduca bzw. mit F-Aktin aus Kaninchenmuskel
als Positivkontrolle 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen der Kügelchen wurden
die gebundenen Proteine durch Kochen in Laemmli-Puffer mit 9,6 mM ß-Mercaptoethanol eluiert, per SDS-
PAGE getrennt, auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen, zunächst mit Ponceau und dann mit dem Antiserum
gegen Aktin getestet. 1 und 3, Inkubation mit 24 µM F-Aktin; 2 und 4, Inkubation mit Zytosol aus dem Mitteldarm
von Manduca.
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