Wechselwirkungen der V-ATPasevon Manduca sexta mit dem Aktin ...

Methoden
vagen) ligiert. Die rekombinanten Plasmide wurden in E. coli BL21(DE3)/pLysS-Zellen
transformiert und in Gegenwart von 0.4 mM IPTG 3 Stunden bei 37°C exprimiert. Beide re-
kombinanten Proteine wurden nach dem oben erwähnten Protokol aus Inclusionbodies gerei-
nigt.
3.2.6. Injektion von siRNA
Die Sequenz UUUAUAGUUGAGGCUGAGGUU wurde als Antisense für die Un-
tereinheit C aus Manduca ausgesucht (Kriterien: 50-100 nt vom Startkodon; 30% < G/C <
70%). Die Einmaligkeit der ausgesuchten Sequenz wurde anhand der genomischen Sequenzen
von Drosophila melanogaster, die, soweit bekannt, hohe Ähnlichkeiten mit bekannten DNA-
Sequenzen von Manduca besitzen, kontrolliert. Die siRNA wurde von MWG-Biotech bezo-
gen.
Die Raupen, die innerhalb von 5 Stunden schlüpften, wurden alle gleichzeitig auf
Futter gesetzt. Nach weiteren 18 Stunden wurden Raupen, die sich im ersten Larvenstadium
befanden und ein Gewicht von ca. 6 mg hatten, für das Experiment verwendet. Die Menge der
injizierten siRNA basierte auf Angaben für adulte Drosophila (Dzitoyeva et al., 2003), wobei
auf das Körpergewicht der Raupen umgerechnet wurde. Nach 2-3-minütiger Betäubung der
Raupen auf Eis wurden die Analhörner abgeschnitten und die siRNA in die entstandenen Öff-
nungen mit einer zugespitzten Glasselektrode mittels einer Nanoliter-Pumpe (1400 EC, WPI)
eingespritzt. Die Injektion dauerte 1 min und wurde mit einer Geschwindigkeit von 100
nl/min durchgeführt. Als Kontrolle wurde ein entsprechendes Volumen Puffer injiziert.
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