Wechselwirkungen der V-ATPasevon Manduca sexta mit dem Aktin ...

Ergebnisse
Wie schon bekannt war und die Immunfärbung (Abb. 3, rechts, A, C und D) bestätig-
te, kommt die V-ATPase in den apikalen Membranen der Malpighi-Gefäße, der Speicheldrü-
sen und der Gobletzellen reichlich vor. Das Gleiche gilt für Aktinfilamente, die zusätzlich
auch in besonders hoher Konzentration in der apikalen Membran der Columnarzellen des Mit-
teldarms vorliegen (Abb. 2, links; A, C und D). Damit war geklärt, dass die V-ATPase und
Aktinfilamente co-lokalisieren, d.h., im konfokalen Mikroskop als zumindest nahe benachbart
identifiziert werden konnten.
4.1.2. Co-Pelletierung des V1Vo-Holoenzyms und des V1-Komplexes mit Aktin
Die Co-Lokalisation der V-ATPase mit Aktinfilamenten lässt sich zwar als Hinweis
auf eine mögliche Interaktion der V-ATPase mit Aktin verstehen, beweist diese Annahme
aber noch nicht. Um eine direkte Bindung der V-ATPase an Aktinfilamente zu testen, wurde
in vitro eine Co-Pelletierung durchgeführt. Hierzu wurde aus Kaninchenmuskel gereinigtes
Aktin verwendet, das 93 % Identität und 98 % Ähnlichkeit zum Aktin von Manduca aufweist.
Das V1Vo-Holoenzym beziehungsweise der V1-Komplex wurde in verschiedenen Konzentra-
tionen mit 0,2 µM Aktin inkubiert und danach bei 200.000 x g 1 Stunde zentrifugiert. Nach
SDS-PAGE und Silber-Färbung fand sich sowohl das V1Vo-Holoenzym (Abb. 4A) als auch
der V1-Komplex (Abb. 4B) in konzentrationsabhängiger Weise im Pellet zusammen mit Ak-
tin. Dies bedeutet, dass die V-ATPase aus Tabakschwärmerraupen direkt an Aktinfilamente
bindet.
Die Proteinbestimmung der Pellets ergab, dass ca. 0,04 µM V1Vo-Holoenzym bzw.
ca. 0,05 µM V1-Komplex mit 0,2 µM Aktin im Sättigungsbereich co-pelletieren (Abb. 4C).
Die daraus folgende Stöchiometrie entspricht damit einer V-ATPase pro 4-5 F-Aktin-
Monomere und passt gut zur bei der Rinder-V-ATPase gefundenen Stöchiometrie von 1:8
(Lee et al., 1999).
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