Wechselwirkungen der V-ATPasevon Manduca sexta mit dem Aktin ...

Methoden
Eigenschaft des Amidoschwarz, an basische Aminosäuren zu binden, beruht (Wieczorek et
al., 1990). Die Proben wurden zuerst mit 0,3 ml Amidoschwarzlösung 5 Minuten bei Raum-
temperatur inkubiert und danach 4 Minuten bei 16.000 x g (Eppendorf-Tischzentrifuge)
zentrifugiert. Das Pellet wurde durch Vortexen in 0,5 ml Essigsäure/Methanol (1:10) und
nachfolgender Zentrifugation zweimal gewaschen und schließlich in 0,35 ml 0,1 N NaOH ge-
löst. Die Absorption wurde bei 615 nm gemessen. Die Proteinmenge wurde mit einer gleich-
zeitig erstellten Eichreihe für BSA (2, 4 und 6 µg) bestimmt.
3.1.9. SDS-PAGE
Die diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) nach
Laemmli (1970) wurde in vertikalen Gelkammern (BIORAD, Biometra) durchgeführt. Prote-
inproben wurden in Laemmli-Puffer mit 2 % ß-Mercaptoethanol in der Regel 45 Sekunden
bei 100°C erhitzt und auf Eis abgekühlt. Sie wurden sofort auf ein Gel geladen oder bei -20°C
gelagert. Die Sammelgele bestanden aus 5,4 % T/2,3 % C Acrylamid, 0,2 % SDS in 125 mM
Tris-HCl, pH 6,8 und die Trenngele aus 17 % T/0,4 % C Acrylamid, 0,1 % SDS in 330 mM
Tris-HCl, pH 8,7. Die Elektrophorese wurde im Laufpuffer, der 0,1 M Tris, 0,1 M Glycin, 0,1
% SDS, pH 8,8 enthielt, mit einer konstanten Stromstärke von 15mA/Gel für ein Sammelgel
und von 35 mA/Gel für ein Trenngel durchgeführt.
3.1.10. SDS-Gel-Färbung mit Coomassie
Die SDS-Gele wurden nach Bollag und Edelstein (1991) mindestens 30 Minuten bei
Raumtemperatur in Coomassie-Lösung (0,25 % Coomassie Brilliant-Blue R-250 w/v, 50 %
Methanol und 10 % Essigsäure) fixiert und gefärbt. In der Regel wurden die Gele durch das
Kochen in Wasser in einer Haushaltsmikrowelle entfärbt. Beim Arbeiten mit radioaktivem
ATP wurden die Gele 30 Minuten in Entfärber I und danach 1 Stunde in Entfärber II entfärbt.
3.1.11. SDS-Gel-Färbung mit Silbernitrat
Um geringe Proteinmengen in den SDS-Gelen zu visualisieren, wurde die Silberfär-
bung nach Damerval (1994) durchgeführt. Nach SDS-PAGE wurden die Gele mindestens 15
Minuten in 50 % Methanol und 10 % Essigsäure fixiert und anschließend 2 Minuten mit Far-
mers`s Reducer behandelt. Nach mehrmaligem Waschen in H2O und vollständigem Entfernen
des Reducers wurden die Gele in 0,01 % wässrigem AgNO3 15 Minuten inkubiert. Danach
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