1 Die subzelluläre Lokalisation und Wirkung auf a-Tubulin von ...
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eukaryotischen Expressionvector pEGFP-N3 über die Schnittstellen HindIII <strong>und</strong> BamHI<br />
integriert.<br />
<strong>Die</strong> einzelnen Verfahren sind im folgendem beschrieben.<br />
Material:<br />
pBluescript II SK(+/-)<br />
pEGFP-N3 Vector (Clontech Cat-Nr. 6080-1)<br />
pEGFP-C1 Vector (Clontech Cat-Nr. 6084-1)<br />
- Eine Kartierung der Vektoren befindet sich im Anhang<br />
3.2.1.1 Gewinnung <strong>von</strong> Spastin-cDNA durch PCR<br />
Das Prinzip der PCR (Polymerase Chain Reaction) beruht <strong>auf</strong> der Fähigkeit <strong>von</strong> DNA-<br />
Polymerasen einen existenten DNA Einzelstrang <strong>von</strong> einem hybridisiertem Oligonukleotid<br />
aus, dem Primer, zu einem Doppelstrang zu vervollständigen. Durch mehrmaliges<br />
Wiederholen der Einzelschritte der PCR, d.h. DNA-Denaturierung, Hybridisieren der<br />
Oligonukleotidprimer <strong>und</strong> anschließender Polymerasereaktion, kann eine exponentielle<br />
Anreicherung der gewünschten DNA erreicht werden. Aus diesen unterschiedlichen DNA<br />
Fragmenten wird mit Hilfe eines geeigneten DNA-Primerpaares im Ansatz, das gewünschte<br />
DNA-Stück im weiteren Verl<strong>auf</strong> der PCR amplifiziert.<br />
Material:<br />
PCR-10xAnsatz: 75µl Aqua dest.<br />
12µl 10xPuffer<br />
5µl dNTP (pro Nukleotid 10mM)<br />
5µl MgCl 2 (50mM)<br />
1µl Primer1 (2pm/µl)<br />
1µl Primer2 (2pm/µl)<br />
Hotstart-Mix:<br />
10xPuffer:<br />
26µl Aqua dest.<br />
3µl 10xPuffer<br />
1,2µl Taq-Polymerase<br />
100mM Tris –HCl<br />
500mM KCl<br />
15mM MgCl 2<br />
0,1% Gelatine, pH8,2<br />
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