1 Die subzelluläre Lokalisation und Wirkung auf a-Tubulin von ...

Durchführung:
Die Zellen wurden nach Absaugen des Mediums mit Trypsin abgelöst, die
550ml Kulturflasche mit 10ml und die 250ml Kulturflasche mit 5ml. 10
Minuten mit 800U/min bei ca. 20°C zentrifugiert und der Überstand
abgesaugt. Der Zellbestand einer 550ml Kulturflasche wurde in 500µl
Einfriermedium in einem Kryotube resuspendiert und stufenweise
heruntergekühlt bis -80°C. Bei dieser Temperatur wurden die Zellen in den
Stickstofftank verbracht.
Zum Anlegen einer neuen Kultur wurden die Zellen so schnell wie möglich
aufgetaut und in ihrem vorgewärmten Nährmedium gelöst.
3.2.8 Transiente Transformation eukaryotischer Zellen
Um das Spastin als Protein exprimieren zu können, wurde das gentragende Plasmid in die
Zellen transfiziert. Da eukaryotische Zellen DNA nicht effizient aufnehmen, muss die DNA
mit einem Transfektionsreagenz vorinkubiert werden. In dieser Arbeit wurde Lipofektamin
eingesetzt.
Material:
Lipofektamin (Invitrogen, Karlsruhe)
OptiMEM
Objektträger mit Kammern
Durchführung:
Um die mikroskopische Auswertung zu vereinfachen, wurden die Zellen
zunächst in Glasobjektträgern mit einem entfernbaren Kammeraufbau
angezüchtet. Hierbei wurden beim 8-Kammerträger pro Kammer 14.000
Zellen ausgesät, beim 2-Kammerträger 20.000. Die Zellen wurden über
Nacht im Brutschrank inkubiert. Hela und B16 bei 37°C, St14A wahlweise
bei 33°C oder bei 39°C.
Für die 8-Kammerträger wurde 1µl Lipofektamin zu 24µl OptiMEM
gegeben, sowie 6µl der DNA mit einer Konzentration von 200ng/µl zu 19µl
OptiMEM. Nach 5 Minuten wurden diese zwei Ansätze zusammengegeben
und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Kurz vor Ablauf dieser Zeit
wurde das Medium aus den Kammern gesaugt und durch 200µl OptiMEM
ersetzt. Dazu kamen dann 50µl der DNA-Lipofektamin-Mischung. Die
Objekträger wurden im Brutschrank für 6-8 Stunden inkubiert.
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