1 Die subzelluläre Lokalisation und Wirkung auf a-Tubulin von ...

3.2.4.1 Einbringen der Spastin-cDNA in den Klonierungsvektor
Um in den Wirt transformiert zu werden, muss die Spastin-cDNA in einen geeigneten Vektor
legiert werden. Der innerhalb des Kits angebotene Vektor, der pCR4-TOPO-Vektor (s.
Anhang), verleiht dem Bakterium Resistenz gegen Ampicillin, das somit als Selektionsmarker
dient. Die in der PCR verwendete Taq-Polymerase fügt an den 3`-Enden der DNA Adenosin
Überhänge an, mit deren Hilfe das DNA-Fragment in den Vektor legiert werden kann.
Material:
Invitrogen TOPO TA Cloning Kit (Cat.-Nr. K4575-J10)
Enthält: 10xPuffer: 100 mM Tris-HCl, pH 8.3 (bei 42°C)
500 mM KCl
25 mM MgCl 2
0.01% Gelatine
dNTPs: 12.5 mM dATP; 12.5 mM dCTP
12.5 mM dGTP; 12.5 mM dTTP
neutralisiert bei pH 8.0 in Aqua dest.
Salzlösung: 1.2 M NaCl
0.06 M MgCl 2
M13Forward Primer: 0.1 µg/µl in TE Puffer
M13Reverse Primer: 0.1 µg/µl in TE Puffer
Durchführung:
4µl des frischen PCR-Produktes wurden mit je 1µl Salzlösung und TOPO-
Vektor zusammenpipettiert, vorsichtig vermischt und für 5 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde sofort auf Eis verbracht und
es wurde mit der Transformation in die kompetenten E. coli Zellen
weiterverfahren.
3.2.4.2 Transformieren in E. coli
Material:
Invitrogen TOPO TA Cloning Kit (Cat.-Nr. K4575-J10)
LB-Medium:
1% Trypton
0,5% Hefeextrakt
0,5% NaCl
pH 7,2 einstellen
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