1 Die subzelluläre Lokalisation und Wirkung auf a-Tubulin von ...

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3.2.2.2 Aufreinigen des PCR-Produktes aus der Elektrophorese ............................. 21 3.2.3 Photometrische Messung der DNA-Konzentration .......................................... 22 3.2.4 Klonieren der Spastin-cDNA............................................................................ 22 3.2.4.1 Einbringen der Spastin-cDNA in den Klonierungsvektor ........................... 23 3.2.4.2 Transformieren in E. coli .............................................................................. 23 3.2.4.3 Klonieren in E. coli ....................................................................................... 24 3.2.4.4 Anlegen eines Bakterien-Gefrierstockes ...................................................... 25 3.2.4.5 Aufreinigen der klonierten Spastin-cDNA aus E. coli ................................. 25 3.2.5 Sequenzieren der DNA ..................................................................................... 26 3.2.5.1 Sequenzier-PCR ........................................................................................... 26 3.2.5.2 Sequenzanalyse mit Licor Long Readir 4200............................................... 28 3.2.6 Mutagenese der Spastin-cDNA ........................................................................ 29 3.2.7 Eukaryontische Zellkulturen ............................................................................ 31 3.2.7.1 Zelllinien ....................................................................................................... 31 3.2.7.2 Wachstums- und Kulturbedingungen ........................................................... 32 3.2.7.3 Anlegen eines Gefrierstockes einer eukaryotischen Zellkultur .................... 32 3.2.8 Transiente Transformation eukaryotischer Zellen ............................................ 33 3.2.9 Fixation der Zellen ........................................................................................... 34 3.3 Immunhistochemische Färbungen ............................................................................ 34 3.4 Mikroskopische Auswertung mit einem Konfokalem Fluoreszenzmikroskop ........ 35 4 Ergebnisse ................................................................................................................. 37 4.1 Kontrollen ................................................................................................................. 37 4.2 Transient überexprimierte GFP-Konstrukte ............................................................. 38 4.2.1 GFP-Konstrukte mit Wildtyp-Spastin .............................................................. 38 4.2.2 GFP-Konstrukte mit S44L ................................................................................ 40 4.2.3 GFP-Konstrukte mit K388R ............................................................................. 41 4.2.4 GFP-Konstrukte und Spastin-Antikörper ......................................................... 42 4.3 Native Zellen ............................................................................................................ 43 4.3.1 Antikörper gegen Spastin ................................................................................. 43 4.4 Zusammenfassung der Ergebnisse............................................................................ 45 5 Diskussion ................................................................................................................ 47 5.1 Lokalisation des Spastins ......................................................................................... 47 5.2 Kernlokalisation von Spastin .................................................................................... 48 5.3 Effekt des Spastins auf α-Tubulin ............................................................................ 48 4
6 Schlussfolgerung ...................................................................................................... 51 7 Literatur .................................................................................................................... 52 8 Anhang ..................................................................................................................... 59 8.1 Vektoren ................................................................................................................... 59 5
Seite 1 und 2: Die subzelluläre Lokalisation und
Seite 3: Inhaltsverzeichnis 1 Die subzellul
Seite 7 und 8: 2 Einführung 2.1 Hereditäre spast
Seite 9 und 10: 2.1.2 Pathologie der Erkrankung Die
Seite 11 und 12: Genlocus Genprodukt Vererbungsmodus
Seite 13 und 14: 2.2.3.1 SPG4 assoziierte HSP SPG4 i
Seite 15 und 16: 2.3.3 Strukturähnliche Proteine Da
Seite 17 und 18: 3 Material und Methoden 3.1 Eingese
Seite 19 und 20: eukaryotischen Expressionvector pEG
Seite 21 und 22: Material: 50xTAE-Puffer: 242g Tris-
Seite 23 und 24: 3.2.4.1 Einbringen der Spastin-cDNA
Seite 25 und 26: 3.2.4.4 Anlegen eines Bakterien-Gef
Seite 27 und 28: Basenmix: Sequenzierungsprimer Hybr
Seite 29 und 30: präformierten Taschen wurden je 3
Seite 31 und 32: abgebaut. 45µl der im Kit enthalte
Seite 33 und 34: Durchführung: Die Zellen wurden na
Seite 35 und 36: Ziege Anti-Maus-Antikörper, Cy2 ma
Seite 37 und 38: 4 Ergebnisse 4.1 Kontrollen Zum Ver
Seite 39 und 40: Abbildung 5: Die Abbildungen zeigen
Seite 41 und 42: 4.2.3 GFP-Konstrukte mit K388R In d
Seite 43 und 44: 4.3 Native Zellen 4.3.1 Antikörper
Seite 45 und 46: 4.4 Zusammenfassung der Ergebnisse
Seite 47 und 48: 5 Diskussion 5.1 Lokalisation des S
Seite 49 und 50: Wir konnten in Zellen, die GFP-Kons
Seite 51 und 52: 6 Schlussfolgerung Obwohl sich auch
Seite 53 und 54: Charvin D., Cifuentes-Diaz, Fonknec
Seite 55 und 56:
Hughes C.A., Byrne P.C., Webb S., M
Seite 57 und 58:
Saugier-Veber F, Munnich A, Bonneau
Seite 59:
8 Anhang 8.1 Vektoren 59
Seite 62 und 63:
C U R R I C U L U M V I T A E PERS
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