1 Die subzelluläre Lokalisation und Wirkung auf a-Tubulin von ...

Ziege Anti-Maus-Antikörper, Cy2 markiert
TritonX 100
Durchführung:
Der Inhalt des Objekträgeraufbaus wurde ersetzt durch 0,1% TritonX 100 in
PBS und 5 Minuten inkubiert. Die 2-Kammerträger mit 500µl je Kammer
und die 8-Kammerträger mit 200µl je Kammer. Dieser Schritt wurde noch
zweimal wiederholt. Die Primärantikörper wurden mit PBS in einer 1:500
Verdünnung verwendet. Die Zellen wurden mit 500µl des Antikörper/PBS-
Mix in einer feuchten Kammer für 1 Stunde inkubiert. Die
Sekundärantikörper wurden mit PBS in einer 1:200 Verdünnung verwendet.
Sie wurden nach Absaugen der Objektträgerkammern in Menge und
Vorgehen analog zu den Primärantikörpern inkubiert. Zum Schluss wurde
noch einmal drei Waschschritte mit 0,1% TritonX 100/PBS wie oben
beschrieben durchgeführt.
3.4 Mikroskopische Auswertung mit einem Konfokalem
Fluoreszenzmikroskop
Bei einem konventionellen Fluoreszenzmikroskop wird das Anregungslicht, das das GFP oder
die Sekundärantikörper zum Emittieren von Licht anregt, über einen dichroischen Spiegel
durch ein Objektiv auf das Objekt reflektiert. Das längerwellige Emissionslicht passiert den
Spiegel und kann so durch das Okular betrachtet werden (s. Abbildung 5). Beim konfokalen
Fluoreszenzmikroskop muss das Licht, bevor es auf den dichroischen Spiegel trifft, noch eine
Lochblende passieren. Auch das emittierte Licht muss nach Passage des Spiegels, auf dem
Weg zum Detektor durch eine Lochblende. Mit Hilfe der Lochblenden und der Linse kann das
Licht aus der Brennebene fokussiert werden und störendes Licht aus anderen Objektebenen
ausgeblendet werden. Es wird so allerdings immer nur ein Punkt abgebildet, um ein Bild zu
erhalten, muss die Brennebene des Objekts Punkt für Punkt „gescannt“ werden.
Durchführung:
Es wurde ein Zeiss LSM 510 Laserfluoreszenzmikroskop zur Auswertung
genutzt. Es wurde die von Hersteller empfohlene Einstellung zur
Auswertung von GFP bzw. von Cy2 und Cy3 verwendet.
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