1 Die subzelluläre Lokalisation und Wirkung auf a-Tubulin von ...

3.2.2.2 Aufreinigen des PCR-Produktes aus der Elektrophorese ............................. 21
3.2.3 Photometrische Messung der DNA-Konzentration .......................................... 22
3.2.4 Klonieren der Spastin-cDNA............................................................................ 22
3.2.4.1 Einbringen der Spastin-cDNA in den Klonierungsvektor ........................... 23
3.2.4.2 Transformieren in E. coli .............................................................................. 23
3.2.4.3 Klonieren in E. coli ....................................................................................... 24
3.2.4.4 Anlegen eines Bakterien-Gefrierstockes ...................................................... 25
3.2.4.5 Aufreinigen der klonierten Spastin-cDNA aus E. coli ................................. 25
3.2.5 Sequenzieren der DNA ..................................................................................... 26
3.2.5.1 Sequenzier-PCR ........................................................................................... 26
3.2.5.2 Sequenzanalyse mit Licor Long Readir 4200............................................... 28
3.2.6 Mutagenese der Spastin-cDNA ........................................................................ 29
3.2.7 Eukaryontische Zellkulturen ............................................................................ 31
3.2.7.1 Zelllinien ....................................................................................................... 31
3.2.7.2 Wachstums- und Kulturbedingungen ........................................................... 32
3.2.7.3 Anlegen eines Gefrierstockes einer eukaryotischen Zellkultur .................... 32
3.2.8 Transiente Transformation eukaryotischer Zellen ............................................ 33
3.2.9 Fixation der Zellen ........................................................................................... 34
3.3 Immunhistochemische Färbungen ............................................................................ 34
3.4 Mikroskopische Auswertung mit einem Konfokalem Fluoreszenzmikroskop ........ 35
4 Ergebnisse ................................................................................................................. 37
4.1 Kontrollen ................................................................................................................. 37
4.2 Transient überexprimierte GFP-Konstrukte ............................................................. 38
4.2.1 GFP-Konstrukte mit Wildtyp-Spastin .............................................................. 38
4.2.2 GFP-Konstrukte mit S44L ................................................................................ 40
4.2.3 GFP-Konstrukte mit K388R ............................................................................. 41
4.2.4 GFP-Konstrukte und Spastin-Antikörper ......................................................... 42
4.3 Native Zellen ............................................................................................................ 43
4.3.1 Antikörper gegen Spastin ................................................................................. 43
4.4 Zusammenfassung der Ergebnisse............................................................................ 45
5 Diskussion ................................................................................................................ 47
5.1 Lokalisation des Spastins ......................................................................................... 47
5.2 Kernlokalisation von Spastin .................................................................................... 48
5.3 Effekt des Spastins auf α-Tubulin ............................................................................ 48
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