1 Die subzelluläre Lokalisation und Wirkung auf a-Tubulin von ...

Basenmix:
Sequenzierungsprimer
Hybridisierungstemperatur:
T3: 5´- AAT TAA CCC TCA CTA AAG GG -3´ 56°C
2s: 5´- TAC TTT CAT CTG CAA CAC AAT -3´ 56°C
4s: 5´- CGA GTA CAT CTC CAT TGC C -3´ 56,7°C
6s: 5´- TGT GGA CAG CAA CCT TGC -3´ 56°C
7s: 5´- GGT CTT GTG GCC TAT TAG TTG C -3´ 58,9°C
8s: 5´- TGG ATA CTC AGG AAG TGA CC -3´ 56°C
11s: 5´- GCA GAA TCG AAT GCA ACC TTC -3´ 56°C
M13rev: 5´- CAG GAA ACA GCT ATG ACC -3´ 55°C
- bis auf 4s sind alle Sequenzierungsprimer mit dem Farbstoff IRD 800
markiert,
4s ist mit dem Farbstoff IRD 700 markiert
Durchführung:
Zunächst wurde ein Ansatz mit 10µl der DNA vorbereitet. In einer 96-Well-
Platte wurden danach je 2µl der Basen, diese enthielten bereits die
Polymerase und einen passenden Puffer, in getrennte Well`s pipettiert.
Sofort wurden je 5µl des beschriebenen PCR-Ansatzes auf die 4 Well’s
pipettiert, jedes Well mit 10µl Wachs verschlossen und in einen PCR-Block
gegeben. Das Programm lautete:
1. 94°C für 3 Minuten
2. die folgenden drei Heizstufen wiederholten sich
35mal
94°C für 30 Sekunden
Hybridisierungstemp. des Primers für 30 Sekunden
72°C für 30 Sekunden
3. 72°C für 3 Minuten
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